CRISPR/Cas技术作为一种简单、廉价且高效的基因编辑技术,深受科学家的追捧,且在生物相关领域被广泛应用,并取得显著成就。碱基编辑器作为“基因魔剪”在遗传疾病的治疗方面有很大的发展前景,但由于被作为哺乳动物细胞标准递送系统的r AAV对所递送的DNA大小有一定的限制。另外,现有的碱基编辑器编辑效率不高,编辑窗口不理想。针对上述问题,本研究设计并创建了分别基于Intein与PB1-PB2的分离式碱基编辑器,并检测了新碱基编辑器的编辑效率和编辑窗口。另外,本研究还建立了基于ccd B和Suc B的大肠杆菌胞内基因编辑效率检测方法,为后续碱基编辑器的分子定向改造奠定基础。第一,构建了一种基于蛋白内含子（Intein）的n Cas9-CBE碱基编辑器。本研究将n Cas9-CBE碱基编辑系统与蛋白反式剪接机制相结合,构建了基于蛋白内含子（Intein）的n Cas9-CBE碱基编辑器,从而对经典CBE碱基编辑器进行了改造,使得n Cas9和胞嘧啶脱氨酶APOBEC可以分别表达,并在胞内通过Intein作用构建成融合蛋白。第二,构建了一种基于PB1-PB2相互作用的大肠杆菌CBE碱基编辑器。本研究尝试利用来源于甲型流感病毒的PB1的C末端（PB1-Cter）和PB2的N末端（PB2-Nter）所具有的高特异性相互作用的原理及优势,将PB1-Cter和APOBEC融合,PB2-Nter和n Cas9融合,使其分别表达后,在胞内形成复合物,从而降低融合基因的大小,同时改变胞内复合物中n Cas9和APOBEC之间“linker”的长度,而对经典CBE碱基编辑器进行了改造,且可以分析、比较编辑效率与基于Intein改造后的碱基编辑器。第三,构建了一系列穿梭表达载体,为方便地在大肠杆菌与酵母中同时实现碱基编辑奠定基础。现有的碱基编辑器都只能在一种或一类细胞中发挥作用,多物种的编辑则需要构建不同的表达载体,为研究带来不变。为解决这一问题,本研究构建了穿梭表达载体,包含大肠杆菌和酿酒酵母表达碱基编辑器的原件,从而可以在大肠杆菌和酵母中实现蛋白表达和基因编辑。在构建穿梭载体过程中,采用的是最新一代Cas9蛋白变体Sp RY,该突变体的PAM更加灵活,同时具备较强保真性。在此基础上,还设计和构建穿梭质粒,表达n Cas9-Sp RY,为保证PAM灵活性的前提下,进一步增强基因编辑的保真性提供可能。第四,建立起基于ccd B和Suc B基因的大肠杆菌胞内基因编辑效率检测方法。通过基因编辑前后ccd B和Suc B的表达引起大肠杆菌表型的变化快速检测基因编辑的效果。该检测系统的构建,为后续的基因编辑器的定向进化奠定了坚实的基础。