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磷是植物正常生长所必需的大量元素,土壤中的总磷储量虽然丰富,但多以难溶性磷或有机磷等形式存在,不可以直接被植物体吸收利用,所以植物经常会面临低磷的胁迫。在低磷条件下,植物可以通过根际酸化作用促进土壤中难溶性磷的溶解,提高植物根际周围有效磷的浓度,以此增加植物对土壤中磷的吸收和利用。但植物如何感知低磷信号进而调控根际酸化的分子机制至今还不清楚。 课题在前期工作中,利用pH指示剂溴甲酚紫进行原位显色,依此筛选得到一株根际酸化缺失突变体pdrad1-1。在低磷条件下,该突变体的根际酸化能力弱于WT,花青素含量及侧根密度低于WT,表现出对低磷胁迫不敏感的特性。此外,该突变体叶中磷含量高于WT,且地上部分与地下部分磷含量的比值高于WT,表明其从地下部分到地上部分的磷转运能力强于 WT。图位克隆结果表明,PDRAD1定位于5号染色体上端。突变体基因在编码区缺失25bp的碱基,移码突变致使蛋白质翻译提前终止。从Salk实验室获得的等位T-DNA插入突变体 pdrad1-2,其在低磷胁迫下表型特征与该突变体表现基本一致。 本实验利用突变体pdrad1-1,pdrad1-2以及转基因回补株系和超表达株系,进一步研究了PDRAD1基因在低磷诱导的根际酸化及磷营养利用方面的作用。利用pH原位显色法测定植株的根际酸化的实验结果显示,在低磷胁迫下,突变体pdrad1-1,pdrad1-2的根际酸化能力一致,均弱于WT;PDRAD1转基因回补株系的根际酸化能力与WT一致;而超表达株系的根际酸化能力明显强于WT。另外,转基因回补株系在低磷胁迫下表现出与WT一致的花青素积累及侧根密度增加的典型低磷胁迫特征;且从地下部分到地上部分的磷转运能力基本与WT一致,均弱于突变体。以上结果表明,PDRAD1参与调节低磷诱导的根际酸化反应和无机磷在植物体内的转运。 GUS转基因植株染色结果显示,该基因在叶片和根中都有表达,且在低磷处理后染色加深;对 GUS酶活测定,发现其在低磷胁迫下活性升高。以上结果说明,低磷诱导PDRAD1表达。在培养基中加入细胞质膜H+-ATPase特异性抑制剂Na3VO4后,正常和低磷培养基上的根际酸化反应均受到了明显抑制;测定突变体pdrad1-1以及部分超表达株系根部细胞质膜上 H+-ATPase活性,发现在低磷胁迫下,突变体 pdrad1-1质膜上的H+-ATPase活性显著低于WT,而超表达株系质膜上的H+-ATPase活性高于WT;此外本实验还利用液相色谱和质谱联用法,测定了植株根系分泌物中的有机酸含量,结果发现在低磷胁迫下,突变体根系分泌物中有机酸含量普遍低于WT,且以琥珀酸含量的差异最为明显。综上表明,突变基因可能通过调节质膜上H+-ATPase的活性和根际有机酸的分泌来影响突变体的根际酸化能力。另外,对突变体及超表达株系的侧根及根毛密度观测分析,结果发现,突变体pdrad1-1的侧根及根毛密度均小于野生型WT,而超表达植株的根毛密度大于野生型WT,由以上结果推测,PDRAD1影响了植株侧根与根毛的形成和发育。 本实验还对不同浓度氮源处理下的突变体进行了生理生化指标分析和磷含量测定,结果发现在缺铵条件下,突变体的磷转运能力进一步提高;此外在低磷条件下,植物组织中的铵会得到大量积累;以上结果说明该基因对营养元素氮和磷都有调控作用。另外, PDRAD1::pCAMBIA1300-GFP载体的构建,为进一步分析基因 PDRAD1的亚细胞定位及其与磷的关系准备了材料。