猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是冠状病毒成员,可导致各种年龄的猪发生呕吐、水样腹泻以致脱水死亡,新生仔猪的发病率和死亡率可达100%。该病在全球范围内分布很广,给世界的养猪业带来非常严重的经济损失。从2010年,我国许多省份的猪场相继发生了严重的腹泻(疑似病毒性腹泻),发病率和死亡率都极高,黑龙江省各地免疫过的猪场也难以幸免。鉴于此,本实验室于2012年3月～2012年12月收集白黑龙江省和l内蒙占自治区猪场共10份发生严重腹泻的仔猪小肠及粪便样品,通过RT-PCR法确定了病原,其中9份为PEDV单独感染,1份与猪轮状病毒混合感染,无TGEV感染情况。结果表明黑龙江省腹泻病原中,PEDV主导。本研究通过RT-PCR法克隆了10株PEDV S1区基因以及其中HLJ-2012株的结构基因及ORF3基因,分别克隆到pMD18-T载体上,筛选出阳性重组子进行序列的测定,并与参考毒株进行序列比较、分析,构建系统发育树,分析本实验中的流行毒株与参考毒株的遗传变异情况和系统发育关系。10株PEDV SI区基因均由2376个核苷酸组成,核苷酸同源性为86.8%-99.7%,与参考毒株相比,除点突变外,10株PEDV S1I区基因均有碱基3的倍数插入、缺失情况及重组情况发生,这导致了S蛋白氨基酸的改变,从而导致了PEDV的变异。构建的系统发育树表明：S基因S1区水平上共分为两个群,本实验中的10株均处在G1群,与2011-2012年3株其他地区毒株CH/SDQD/2011、CH/HBQHD/2011和HuN亲缘关系很近,而与G2群中的经典毒株CV777及我国以往报道过的LJB/03等亲缘关系较远。对HLJ-2012株的结构基因序列的分析表明：结构基因S、E、M、N及ORF3基因分别由4161、231、681、1326和675个核苷酸组成。与经典毒株CV777及我国以往报道过的毒株相比：碱基缺失、插入和点突变主要集中在S基因5’端,导致S蛋白氨基端出现大量氨基酸的变化；E、M、N及ORF3基因相对保守,但分别出现一些点突变导致了氨基酸的变化：E基因的第94位碱基(G-A)导致E蛋白第65位(R-Q)发生变化；M基因的第567位碱基(T-C)和第632位碱基(A-G)导致M蛋白第211位(N-S)；N基因分别在132(G-A),185(G-A),231(C-T),357(A-T),708(A-C)发生变化,相应编码的氨基酸62(R-H); ORF3基因的测序结果表明,HLJ-2012株与2011年后中国野毒株(除CH/BJ/2011、CH/HLJHH-1/2011)(?)韩国毒株有着密切的亲缘关系,与疫苗毒株的遗传关系不大。通过S基因系统发育树,HLJ-2012株属于G1群中G1-1亚群。以家兔为模型免疫HLJ-2012组织原毒,间接ELISA法检测血清抗体效价可达1：12800。将本实验室分离鉴定的猪流行性腹泻病毒(LJB/03株,滴度105。67TCID50/ml),稀释至200TClD5o病毒液与不同稀释倍数的血清混合后感染Vero细胞,通过中和试验,判断出其对传统毒株LJB/03具有一定的中和效应,Reed-Muench氏法计算得出其中和效价为1：53.83。采用传代细胞(非洲绿候肾细胞vero)将HLJ-2012株分离出来。该病毒接种Vero细胞时,在吸附液和维持液中均加入6μg/ml浓度的胰酶,通过稳定的细胞病变的观察、病毒的TCID50的滴定、反转录-聚合酶链式反应、间接免疫荧光试验、间接ELISA试验和电镜观察方法对该分离毒进行了鉴定。结果表明：病毒盲传20代以后,48小时就出现细胞病变(CPE)。随着传代次数的增加,出现CPE的时间缩短,40代之后,接种vero细胞至72h,折光性增强,胞内颗粒物增多,大部分细胞脱落,剩下贴壁的细胞变成黑色团状；正常细胞一直保持致密单层,轮廓清晰,极少脱落。对20、25、30、35、40和45代细胞培养物进行RT-nestPCR检测,结果显示均为阳性。对第45代病毒的M基因部分片段进行序列的测定,结果显示：第45代毒与原始HLJ-2012病毒有98%的同源性,证明PEDV HLJ-2012在Vero细胞上繁殖稳定。通过普通电镜观察,该病毒呈现有囊膜的皇冠状,直径约为100nm以上。间接免疫荧光实验结果表明,经PEDV感染24h后的Vero细胞,在细胞中检测到病毒抗原的存在,可见绿色荧光,而阴性对照组Vero细胞中,看不见明显荧光信号。间接ELISA检测,P／N平均比值为7.25,判断此细胞培养毒为阳性。