[研究背景和目的]慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是起源于多能造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病,其分子生物学基础为染色体畸变与异常融合基因的形成。以白血病细胞异常增生及浸润为主要特征。临床表现为脾脏肿大、外周血白细胞极度升高并出现幼稚粒细胞,嗜碱、嗜酸粒细胞增多,常有贫血、血小板增多。CML分为慢性期(chronic phase, CP)、加速期(accelerate phase,AP)、急变期(blast crisis,BC),急变期可有骨髓外原始细胞浸润,如皮肤或脏器浸润,甚至出现中枢神经系统白血病。近年来,国内外学者对白血病的研究在基础与临床方面均取得了重大进展,新型的分子靶向药物及改良化疗方案的推出使白血病的治疗取得了巨大进步,异基因造血干细胞移植也极大提高了白血病患者的生存率。但是,白血病的髓外浸润依然是临床上亟待解决的问题,初诊时伴髓外浸润的病人往往化疗效果欠佳且易复发,髓外白血病亦常常成为造血干细胞移植后复发的根源；而目前尚无常规手段对白血病髓外浸润进行全面监测。因此对白血病髓外浸润的相关机制进行详细研究、探索相关的分子及信号通路异常、寻找可以利用的靶点,髓外白血病的早期诊断和治疗具有实际意义。白血病髓外浸润与细胞侵袭性增强密切相关。侵袭性是恶性肿瘤的重要生物学特征,侵袭性高的肿瘤细胞在分泌各种溶解酶破坏细胞外基质的同时,还可通过增强的迁移能力使其更容易向周围组织浸润。如前所述,CML在进展到急变期后易发生髓外浸润,这与CML细胞的侵袭力增强是分不开的。细胞表面受体与配体的结合可调节细胞迁移,这个过程包括细胞表面受体与邻近细胞表面配体结合、受体配体结合激活调控信号进入细胞内、调控信号重塑细胞骨架使细胞发生定向伸展运动。研究表明,Eph受体家族整合信号是调节细胞迁移与侵袭的关键点,Eph受体家族有望成为监测及治疗白血病髓外浸润的突破口。促红细胞生成素产生肝细胞(erythropoietin-producing human hepatocellular, Eph)受体家族为酪氨酸激酶受体家族(receptor tyrosine kinases, RTKs)中最大的亚群,目前共有25个成员,包括16个Eph受体：EphA (EphA1-EphA10)、EphB (EphB1-EphB6)与9个ephrin配体：ephrinA(ephrinA1-ephrinA6).ephrinB(ephrinB1-ephrinB3)。由于此家族中的每个成员均具有扮演配体或受体角色的能力,因此Eph/ephrin能够结合双向信号,当不同细胞表面的Eph受体与ephrin配体结合后可同时发生酪氨酸磷酸化,从而介导双向信号传递,激活多重下游信号通路,主要包括Ras/Raf/MAPK与PI-3K/AKT信号转导途径,且这些信号通路中多有交叉。其中,在众多的下游信号蛋白中,小G蛋白Rho GTP酶的激活可致细胞骨架重塑而改变细胞粘附、极性及运动方向,是细胞间CIL作用的重要调控者。目前关于EphA4在CML髓外浸润方面的研究尚未见报道。EphA4受体的构象具有多样性,是唯一能够与所有九个ephrin配体相结合的受体。EphA4所具有的这种可以和多种ephrin配体结合的特性,使得EphA4能够广泛参与生物功能的执行和调节。大量研究表明,EphA4作为重要的细胞信号转导蛋白,被相应配体激活后,能够调整细胞形态,在细胞迁移、细胞-细胞作用、细胞-基质作用、细胞凋亡和增殖中起重要作用。在肿瘤研究方面,EphA4的表达与胃癌的转移、分期具有相关性；在神经研究方面,EphA4的上调会论过对细胞骨架、形态的调节促进树突棘的回缩而降低其密度。Astin JW等发在前列腺癌中,高表达EphA分子的前列腺癌细胞间相互接触后可激活Eph/分子,促使细胞间相互排斥进而使肿瘤扩散,且通过Rho GTP酶实现其对细胞骨架的重构。基于这样的研究基础,我们推测,作为一个这样功能繁冗、机制复杂的受体蛋白,EphA4及其下游信号蛋白在CML的发生发展中特别是在与白血病细胞侵袭力相关的髓外浸润中可能也具有一定的作用与调节机制,这是一个值得研究的课题,其意义在于寻找对抗白血病髓外浸润的治疗靶点。K562来源于慢性髓系白血病红白血病急性变患者,具有血管新生及浸润的潜能,可选择该细胞株用于研究EphA4在白血病发生发展中发生髓外浸润的作用机制问题。本研究首先对髓系白血病原代细胞中EphA4受体的表达情况进行了考察,进而对K562中EphA4mRNA水平和蛋白表达水平进行初探,其后通过基因技术建立过表达EphA4的K562稳定细胞株(K562-EphA4),观察EphA4的过表达对其下游与侵袭力相关的蛋白RhoA、 Rac1、cdc42的影响,并以功能学实验验证其髓外浸润能力的变化。通过这些观察,我们将对EphA4在CML中对下游信号的调控以及其与髓外浸润的关系有所认识,从而为白血病髓外浸润行为寻找更有效的靶标奠定基础,也有利于进一步解决目前髓外白血病难治、复发的难题,对于白血病的防治具有积极的意义。[方法]1.收集临床上无髓外浸润与有髓外浸润的髓系白血病患者骨髓单个核细胞,Western Blot检测其EphA4蛋白的表达情况；培养慢性粒细胞白血病急红变株K562细胞,于对数期生长期与正常人骨髓单个核细胞同时进行荧光实时定量PCR检测其EphA4的mRNA水平、Western Blot检测其EphA4蛋白表达水平。2.由于K562细胞中EphA4mRNA的表达丰度较低,故通过制备EphA4重组克隆并进行测序、构建慢病毒载体、包装慢病毒并感染至K562细胞等一系列过程构建过表达EphA4的K562稳定细胞株(K562-EphA4),用于后续对EphA4下游信号蛋白的研究与功能学研究。3.Western Blot检测磷酸化RhoA蛋白与磷酸化Rac1/cdc42蛋白在K562细胞与K562-EphA4细胞中的表达水平,以考察EphA4对于这三种蛋白活性的调节作用。4.通过体外迁移实验与体外侵袭实验对K562细胞与K562-EphA4细胞的侵袭力进行比较,以考察这两种细胞的髓外浸润能力。[结果]1.有髓外浸润症状的髓系白血病患者其骨髓单个核细胞的EphA4蛋白表达水平高于无髓外浸润症状的髓系白血病患者,二者之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。K562细胞中EphA4的mRNA与蛋白水平均高于正常人骨髓单个核细胞中EphA4的水平,二者差异具有统计学意义(P<0.05)。2.成功构建稳定过表达EphA4蛋白的K562细胞株(K562-EphA4)。Western blot检测K562-EphA4细胞的EphA4蛋白表达水平高于K562细胞,二者差异具有统计学意义(P<0.05)。3. Western Blot结果显示,K562-EphA4细胞的磷酸化RhoA蛋白水平与磷酸化Racl/cdc42蛋白水平均高于K562细胞,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.体外迁移实验与体外侵袭实验结果均显示,K562-EphA4细胞穿过微孔膜与基质胶的细胞数量多于K562细胞,二者差异均具有统计学意义(P<0.05)。[结论]1.研究结果从两方面验证了EphA4受体在侵袭力较高的白血病细胞中出现了相对较高的表达,提示我们EphA4受体可能对白血病细胞的侵袭力有所调控。同时结合大量相关文献,我们认为,研究EphA4在白血病细胞侵袭力方面的作用是具有一定意义的。2.已成功建立了过表达EphA4蛋白的K562稳定细胞株(K562-EphA4细胞),为研究EphA4基因与蛋白在白血病发生及进展中的作用及机制建立了基础。3.研究结果提示,EphA4的过表达上调了RhoA蛋白活性、Rac/cdc42蛋白活性,推测RhoA、 Racl、cdc42可能为其下游信号蛋白。并基于大量文献,我们推测EphA4可能通过调节RhoA、Rac1/cdc42蛋白活性而对K562细胞的侵袭能力产生一定的影响。4.体外迁移实验与体外侵袭实验证实,K562-EphA4细胞的迁移与侵袭能力高于K562细胞,提示EphA4的过表达可增强K562细胞的迁移能力与侵袭能力,说明EphA4确对细胞侵袭能力具有一定的调节作用。5.综上,我们认为,EphA4受体可通过上调其下游信号RhoA、Racl、cdc42蛋白活性增强K562细胞侵袭力,从而促进其向髓外组织浸润的能力。因此,EphA4有望成为监测及治疗白血病髓外浸润的靶点,这对CML的治疗具有实际的意义。