脱发(alopecia)是临床上最常见的皮肤病之一,仅在我国,就有超过2亿的人口受到脱发困扰。常见的脱发有斑秃(Alopecia areata,AA),脂溢性脱发(androgenetic alopecia AA)和全身性脱发(Alopeciauniversials,AU)三种类型,引起的原因各不相同,发病机制也不清楚,不能取得满意的治疗效果。结合其家族史和毛囊周期紊乱的共性,这些脱发均具有遗传性。毛囊的生长周期分为生长期、退行期和休止期3个阶段,这是一个高度复杂的过程,多条细胞信号通路构成复杂的网络调控系统,调控毛囊的形态发生和周期变化。因此,研究影响毛发正常生长发育的信号通路及关键细胞因子,可能为解决脱发难题提供重要的思路和切入点。然而,要从众多的信号通路网络中寻找影响毛囊生长的关键因子并非易事。借助自发突变动物模型或遗传工程动物模型研究毛发在特定病理表型下相关生长因子的改变,是现代生物遗传学的重要手段。无毛基因(hairless,Hr)编码的无毛蛋白(HR)对毛乳头与毛囊上皮之间的信号传递及毛囊周期变化具有重要作用,无毛基因的自发突变可引起人和小鼠脱发,无毛基因不同位点的突变可引起人和小鼠身体不同部位、不同程度的脱发,可以推测价是调控毛囊生长的必需因子。以Hr为切入点,通过建立Hr基因工程动物模型,结合自发突变小鼠,深入研究Hr的功能及其功能改变对信号通路的影响,探讨调控毛发生长周期的关键细胞因子及信号通路。前期工作已培育Hr自发突变小鼠(豫医无毛小鼠,YYHL)并构建Hr基因敲除小鼠(KO)。本研究利用Gateway技术在Hr基因的3427位引入点突变(G→A),构建pRP(Exp)-EF1A>mHairlessmutant>IRES/EGFP真核表达载体,显微注射受精卵获得转基因F0代小鼠。PCR鉴定、筛选、交配,成功构建#3、#8和#12三条Hr突变转基因品系。在培育Hr自发突变小鼠、基因敲除小鼠和转基因小鼠(TG)过程中,发现三种小鼠均表现为出生后毛发生长正常,到14日龄开始脱发,但脱发方式有所区别。YYHL和KO小鼠皮肤毛发先稀疏,再脱尽,终生不再长发;转基因小鼠(TG)出生后14天开始从背部脱发,35天时毛发从脱落部位重新生长,并不再脱发。皮肤组织学和透射电镜观察发现,自发突变和基因敲除小鼠脱发时毛囊细胞发生凋亡,提前进入了退化期,并不再进入生长期;转基因小鼠在脱发时经历了同样的改变,但在出生后的第二个毛囊生长周期毛发能重新进入生长期。脱发时转基因小鼠皮肤外源突变Hr的表达显著高于内源Hr基因,而毛发重新生长时内源基因的表达占有显著的优势,说明外源基因抑制了内源基因的表达,突变后功能改变或丧失的无毛蛋白已经失去了原有的功能而导致毛发周期紊乱,引起脱发。为研究Hr对皮肤毛发全基因组转录谱的影响,本文用含45,281个基因的MouseWG-6 v2 Expression BeadChip检测三种基因工程小鼠皮肤组织基因表达谱,运用GO功能注释、IPA(Ingenuity Pathway Analysis)软件对芯片结果进行分析,并与野生小鼠皮肤组织作比较。结果显示,YYHL、KO和TG小鼠开始脱发时背部皮肤分别筛选出1839(包括965个已知功能基因和874个未知基因)、1816(包括1038个已知功能基因和778个未知基因)、2027(包括1238个已知功能基因和789个未知基因)个差异表达基因。转基因小鼠毛发重新生长时差异表达的基因为530个(包括359个已知基因和171个未知基因。GO分析显示差异表达的基因主要涉及到炎症反应、表皮发育、角质形成细胞分化、抗凋亡、细胞粘附、趋化现象、免疫反应、细胞增殖正向调控和细胞信号转导等生物学过程。Kegg通路分析显示,筛选的差异表达基因主要参与了 Notch、BMP、Wnt、P53以及钙信号通路等。免疫组织化学结果表明HR功能改变时,BMP2在毛囊中高表达,这时WNT信号通路中的关键调控因子Catenin几乎检测不到;转基因皮肤毛发重新生长时,BMP通路被抑制,WNT通路被显著激活。Hr是Notch信号通路中的辅阻遏物。芯片结果显示,HR功能改变或丧失时,Notch细胞信号通路中的HES家族基因表达升高,BMP信号通路被激活且抑制了 Wnt通路,毛囊提前进入退化期。HR功能恢复后,平衡重新建立,毛发进入正常的生长周期。此外,芯片检查和免疫组织化学结果都显示脱发时调控角质形成细胞终末分化的CASP-14及构成毛囊结构骨架的角蛋白基因显著上调,透射电镜观察发现角蛋白丝的大量聚集,排列紊乱,细胞中见大量大小不一、类似脂滴的空泡,提示HR蛋白功能丧失或改变时,毛囊干细胞(HFSCs)终末分化为皮脂腺(SG)和角质形成细胞(KC),毛发不能形成。实验结果可能为研究毛发生长发育、毛囊干细胞的分化调控,进而为解决人的脱发难题提供重要思路。