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本实验应用体外和体内实验，在不同衰老程度下应用MT，观察其对神经元退行性病变的保护效果差异，并从线粒体的功能改变来探讨其机制。在体外实验中，应用Aβ25-35作用于不同衰老程度的原代培养海马神经元，观察褪黑素的疗效差异；体内实验应用SAMP8鼠作为AD模型，观察MT对中年和老年鼠学习记忆相关脑区影响的效果差异。在此基础上探讨MT对AD不同发病阶段影响的可能机制，为MT的临床应用提供理论基础，并有助于加深理解AD的发病机制。
材料与方法
1原代培养海马神经元衰老的鉴定分离和培养16-18天胚胎SD大鼠原代海马神经元，用无血清培养基培养，每天观察其形态的变化，同时利用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色和免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase，NSE)来鉴定神经细胞的衰老程度，并利用原子力显微镜进一步观察其形态差异。
2褪黑素对Aβ25-35致不同衰老程度神经元氧化应激、线粒体膜电位损伤及PGC-1α表达影响的检测培养10天和25天神经元均给予20μM的Aμ25-35刺激，同时应用10μM的褪黑素来干预，24 h后，用荧光探针DCFH-DA或荧光染料罗丹明123孵育，在微孔板荧光酶标仪分别检测细胞内氧自由基含量和线粒体膜电位值的变化；应用谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒(比色法)测定细胞匀浆中GSH含量。利用RT-PCR和Western blot检测神经元细胞PGC-1α mRNA和蛋白表达的变化。
3褪黑素改善不同年龄段SAMP8鼠海马神经元退行性病变效果的测试4月龄和7月龄的SAMP8鼠分别给予皮下注射褪黑素(10 mg/Kg·d)15天，相应对照组注射相同剂量和浓度的生理盐水和乙醇，利用Y型迷宫及八臂迷宫试验测试其行为学结果。然后处死取脑组织冰冻切片，进行Gomofi六胺银法染色，观察海马CA1区六胺银法染色颗粒(MSSG)的形态与分布，用Leica显微镜及配套的软件系统和JVC ky-F30B 3-CCD彩色图像掇录系统进行老年斑面积定量分析；用尼氏染色光镜下观察海马CA1区、CA3区锥体细胞层神经元的数量变化。
结论：
1.成功建立无血清原代培养海马神经细胞拟衰老模型；
2.褪黑素不仅能改善A β 25-35引起的未衰老神经细胞内氧自由基升高和GSH值降低，对衰老神经元也有同样的保护效果；
3.褪黑素能改善未衰老神经元A β 25-35引起的线粒体膜电位降低，对衰老神经细胞作用不明显；
4.A β 25-35能降低神经细胞PGC-1α的表达，褪黑素能防止A β 25-35引起的未衰老神经元PGC-1 α蛋白表达降低，对衰老细胞效果不明显；
5.褪黑素可改善SAMP8鼠的学习记忆障碍，对海马CA1区淀粉样颗粒具有一定的清除功能，能够减少海马锥体细胞层的神经元的丢失，提高线粒体膜电位；对年轻鼠的效果比老年鼠更明显；
6.褪黑素改善不同衰老程度海马神经元A β损害效果差异可能与其对线粒体的保护差异有关。