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S1P(Sphingosine-1-phosphate)是一种膜磷脂类分解和代谢产物,在许多生理功能中发挥重要作用。S1P既可作为细胞内第二信使,又可通过S1P转运体转运到细胞外,与细胞膜上的S1P受体结合,再作用于下游信号,产生一系列的生理学效应。研究表明Spns2(spinster homologue 2)参与S1P的转运,在斑马鱼心肌前体细胞的迁移中发挥重要作用,Spns2基因突变会导致斑马鱼出现两个心脏;同时S1P也会在免疫细胞迁移过程中具有重要作用,Spns2-/-造成循环中S1P浓度显著下降,从而导致成熟的T、B淋巴细胞无法迁入到外周循环和外周淋巴器官中。我们在实验过程中发现从日本静冈SLC公司引进的SD-Tg(CAG-EGFP)转基因大鼠(绿大鼠)的EGFP纯合子动物出现以眼部症状为主的异常表型,并且呈隐性方式遗传。据此推测EGFP纯合子转基因大鼠所出现的表型可能由于宿主细胞基因组上的某个基因被EGFP基因插入突变所致。由于EGFP纯合子转基因大鼠的角膜对外界刺激缺乏感知,于是暂时将该内源性突变基因命名为CCSD,即Congenital Corneal Sensory Defect(先天性角膜感觉缺失)。为了分析EGFP纯合子转基因(CCSDegfp/egfp)大鼠眼部症状异常表现的原因,进而阐明CCSD基因的功能,本课题进行了如下的研究工作:1.首先针对CCSDegfp/egfp大鼠进行表型分析和CCSD基因在染色体中的定位。研究发现:(1)CCSDegfp/egfp大鼠除了角膜对外界刺激缺乏感知外,还出现角膜混浊、睑球粘连等异常表型;同时新生CCSDegfp/egfp大鼠发生EOB(eye-open at birth);对动物眼球行石蜡切片,HE染色结果显示CCSDegfp/egfp动物与WT和CCSD+/egfp动物相比:角膜上皮细胞层增厚,基质层有炎性细胞;视网膜分层紊乱,外核层尤为明显。(2)利用巢式PCR,获得了CCSD在基因组插入位点的侧翼序列,将序列进行Blast比对,比对结果显示CCSD基因与大鼠的Spns2基因为同一基因。Spns2基因定位于大鼠第10号染色体上,而EGFP插入到它的第一个内含子中,从而造成其无法转录。以上研究表明,CCSD基因的插入突变造成了EGFP纯合子转基因大鼠—CCSDegfp/egfp异常表型。染色体定位研究发现EGFP插入内源性Spns2基因,造成Spns2基因的表达缺失。因此,CCSD基因和Spns2基因很可能为同一基因。提示CCSDegfp/egfp大鼠所产生的异常表型,可能是由于Spns2突变造成的。2.进一步对CCSDegfp/egfp的表型和已报道的Spns2-/-的小鼠表型进行了对比。首先对CCSDegfp/egfp大鼠外周血中的免疫细胞的数量进行检测,发现CCSDegfp/egfp大鼠外周血中,白细胞数量和T、B淋巴细胞数量明显减少。该表型与Spns2-/-小鼠表型一致,结果进一步确定CCSD和Spns2为同一基因;其次构建Spns2-EGFP融合蛋白表达载体,并将其转染Hela细胞,结果发现Spns2明显表达于细胞膜上;最后通过合成Spns2蛋白N-端和C-端两条多肽,分别免疫新西兰大白兔,建立两株抗-Spns2多克隆抗体:S2(N)和S2(C)。并且这两株抗体可以特异性的识别Spns2蛋白。部分胚胎组织染色显示Spns2在外周血细胞、肝细胞及外周神经节中表达。3.关于Spns2基因缺陷对免疫系统之外的表型影响还不明确,CCSDegfp/egfp大鼠的EOB表型在Spns2-/-小鼠中虽已有报道,但对其产生机制未作进一步的研究。所以我们针对大鼠中发现的这一表型及其分子机制进一步深入研究。利用组织学染色、细胞培养、免疫荧光染色和Western blot等方法研究CCSDegfp/egfp大鼠的EOB表型及产生的分子机制。研究中发现:(1)CCSDegfp/egfp大鼠眼睑缘不能像WT和CCSD+/egfp大鼠那样正常迁出和融合;(2)Spns2表达在WT和CCSD+/egfp大鼠眼睑前缘上,而在CCSDegfp/egfp大鼠眼睛前缘则没有表达;(3)Spns2功能缺失可能是通过降低EGFR磷酸化水平,同时通过MEKK1和c-Jun等细胞内信号途径,造成CCSDegfp/egfp大鼠EOB表型。综上所述,本课题研究中所发现的CCSD基因与Spns2为同一基因,证实了先前宿主细胞基因组上的某个基因被EGFP基因插入突变所致的推测。且通过对CCSDegfp/egfp大鼠EOB表型的研究揭示Spns2除了在免疫系统的功能外,还可以通过干预皮肤角质细胞骨架,以导致角质细胞的迁出困难。此外,本课题还证明CCSDegfp/egfp大鼠是Spns2基因突变的大鼠模型,为进一步深入研究Spns2基因功能提供一个非常好的研究平台。