【研究背景及目的】小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）约占肺癌的15%至20%,是一种高度恶性的神经内分泌肿瘤^[1]。小细胞肺癌的生物学行为恶劣,生长迅速,早期容易侵犯血管和淋巴管,在初次就诊时多数患者已发生全身转移。小细胞肺癌的治疗以化疗为主联合放疗,虽然初治缓解率高,但高耐药率和复发率使得患者的长期生存无明显改善^[2]。长期以来,小细胞肺癌的治疗方法停滞不前,它似乎已经成为了药物研发的坟墓,因此寻找新的治疗策略成为小细胞肺癌领域的重要研究方向。肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）学说为癌症研究提供了新的突破口。肿瘤干细胞就像肿瘤中的种子,是恶性肿瘤组织中数量极少的,却具有无限增殖和多向分化潜能的细胞亚群,它们维持着肿瘤细胞群的生命力,因此又被称为肿瘤发生细胞（tumor initiating cells,TICs）^[3,4]。CSCs具有迁移和运动的能力,通过血行播散到达转移部位后,它们分化为异质性的肿瘤细胞,并通过自我更新维持一定比例,在转移部位生成与原发肿瘤表型一致的肿瘤^[5]。体内微环境中的多种信号通路,比如Hedgehog通路、Wnt/β-catenin通路和Notch通路,是CSCs自我更新、分化和转移的重要调控者。这些信号通路在胚胎发育期与器官的形成有关,成年后在正常组织中呈失活状态,当它们被异常激活时可导致肿瘤形成。三氧化二砷（arsenic trioxide,As₂O₃）又名砒霜或亚砷酸,FDA已批准其临床上用于治疗急性早幼粒白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）。As₂O₃可降解PML-RARα融合蛋白,具有低剂量（0.1-0.5μM）时诱导APL细胞分化、高剂量（0.5-2.0μM）时诱导APL细胞凋亡的双重作用^[6]。随后,关于As₂O₃治疗实体肿瘤的研究层出不穷。研究者发现As₂O₃可以影响调控干细胞自我更新的多条信号通路比如Hedgehog通路和Notch通路来抑制神经胶质瘤^[7,8]、肝癌^[9]及胰腺癌^[10]中的肿瘤干细胞,但这些研究多数仅限于体外水平。目前,关于As₂O₃对小细胞肺癌的作用研究较少。在体外水平,As₂O₃通过诱导活性氧产生、消耗还原型谷胱甘肽以及下调抗凋亡蛋白Bcl-2,激活线粒体凋亡途径来抑制多种小细胞肺癌细胞系的增殖^[11,12]。在体内水平,As₂O₃可抑制小细胞肺癌皮下移植瘤的生长,并上调神经内分泌标志物的表达^[12,13]。本课题组前期研究发现As₂O₃能抑制小细胞肺癌细胞系H446在裸鼠皮下形成移植瘤,这可能与As₂O₃影响肺癌新生血管的数量和形态有关^[14]。我们还初步探讨了As₂O₃对H446细胞系中的肿瘤干细胞样细胞的影响,发现As₂O₃可以抑制H446细胞在无血清条件下形成肿瘤球,下调H446细胞中干细胞表面标志CD133和干细胞转录因子SOX2、OCT4的表达,并抑制与干细胞功能相关的Hedgehog通路的信号分子^[15]。但是,我们之前的研究并未从H446细胞系中分离出CSCs,As₂O₃对小细胞肺癌干细胞的具体作用机制尚未完全清楚,As₂O₃在体内水平对小细胞肺癌干细胞的影响也是一个未知的问题。本课题首先通过无血清培养法从小细胞肺癌细胞株H446和H209中分离出悬浮的肿瘤球,并鉴定肿瘤球细胞是否具有CSCs的特性;然后,通过一系列体外实验（增殖、成球、克隆形成、细胞周期和细胞凋亡）和体内实验,观察As₂O₃对小细胞肺癌干细胞的生长以及对干细胞相关转录因子表达的影响;通过构建SOX2敲减和对照慢病毒,研究SOX2敲减对小细胞肺癌干细胞自我更新的影响;最后,研究Hedgehog通路是否介导了As₂O₃对小细胞肺癌干细胞生长的抑制作用。本课题进一步论证了As₂O₃对小细胞肺癌干细胞的影响及其作用机制,有望为As₂O₃未来应用于小细胞肺癌的临床治疗提供更多的实验依据。【实验方法】第一部分小细胞肺癌干细胞的培养和鉴定首先,是小细胞肺癌干细胞的培养。将小细胞肺癌细胞株H446和H209用干细胞培养液重悬,接种于超低吸附培养皿,培养出悬浮生长的肿瘤球。然后,鉴定肿瘤球的干性。分别用qPCR和Western blot检测普通培养细胞和肿瘤球中干细胞转录因子SOX2、c-Myc、OCT4和NANOG的表达水平;将相同数量（1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶）的普通培养细胞和肿瘤球细胞,分别接种于同一只裸鼠的左侧和右侧背部皮下,比较两组细胞成瘤能力的差异,行HE染色观察肿瘤的组织学形态。第二部分As₂O₃对小细胞肺癌干细胞的体外生长及皮下移植瘤的抑制作用为研究As₂O₃在体外水平对小细胞肺癌干细胞生长的抑制作用,分别用不同浓度的As₂O₃干预H446 CSCs和H209 CSCs,以生理盐水作为对照。用CCK8法检测各组的细胞增殖抑制率;克隆形成实验检测克隆数;成球实验检测成球能力;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期;Western blot检测干细胞转录因子SOX2和c-Myc的表达。为研究SOX2敲减对小细胞肺癌干细胞自我更新能力的影响,分别用对照慢病毒（shNT）和敲减慢病毒（shSOX2）瞬时感染H446 CSCs和H209 CSCs。感染48小时后,在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况;感染72小时后,用qPCR检测SOX2mRNA的表达,Western blot检测凋亡效应蛋白Caspase3 cleavage和PARP cleavage的表达,成球实验比较两组细胞的成球能力。为研究As₂O₃对小细胞肺癌干细胞皮下移植瘤生长的抑制作用,构建H446 CSCs和H209 CSCs皮下移植瘤模型后,用2.5或5.0 mg/kg As₂O₃腹腔注射,以生理盐水作为对照,连续给药14天。比较各组肿瘤的体积和重量;通过TUNEL染色检测各组移植瘤组织中凋亡细胞的比例;免疫荧光染色检测各组移植瘤组织中SOX2和c-Myc染色阳性细胞的比例。第三部分Hedgehog信号通路介导As₂O₃抑制小细胞肺癌干细胞的作用机制研究Hedgehog通路参与维持肿瘤干细胞的功能,而GLI1是Hedgehog通路的关键转录因子。首先,研究As₂O₃在体外水平对小细胞肺癌干细胞中GLI1蛋白及其靶基因PTCH1、n-Myc表达的影响。用不同浓度的As₂O₃干预H446 CSCs和H209 CSCs,Western blot检测GLI1蛋白的表达量,qPCR检测GLI1的下游靶基因PTCH1、n-Myc的表达量。然后,研究As₂O₃在裸鼠体内水平对移植瘤组织中GLI1蛋白及其靶基因PTCH1、n-Myc表达的影响。Western blot检测对照组、2.5 mg/kgAs₂O₃组和5.0 mg/kg As₂O₃组移植瘤组织中GLI1蛋白的表达量,qPCR检测各组移植瘤组织中GLI1的下游靶基因PTCH1、n-Myc的表达量。GANT-61是一种GLI抑制剂。为研究阻断Hedgehog通路能否抑制小细胞肺癌干细胞在体外的生长,并增强As₂O₃的作用。分别用对照、As₂O₃、GANT-61和联合给药干预H446 CSCs和H209 CSCs。用成球实验比较成球能力;流式细胞仪和Western blot检测细胞凋亡;Western blot检测GLI1、SOX2和c-Myc蛋白的表达。为研究阻断Hedgehog通路能否抑制小细胞肺癌干细胞在裸鼠体内的生长,构建H446 CSCs和H209 CSCs皮下移植瘤模型后,用50mg/kg GANT-61干预,以等体积的溶剂（玉米油:无水乙醇=4:1）作为对照,皮下注射,连续给药14天。比较两组肿瘤的体积和重量;分别通过TUNEL染色和免疫荧光检测移植瘤组织中凋亡细胞的比例、SOX2和c-Myc染色阳性细胞的比例。【研究结果】第一部分小细胞肺癌干细胞的培养和鉴定1、小细胞肺癌细胞株H446和H209在特定的无血清条件下培养4-6天后,我们观察到肿瘤球形成。肿瘤球经过30余次的连续传代仍具有很强的增殖能力,提示肿瘤球细胞具有很强的自我更新能力。2、qPCR和Western blot结果显示,H446肿瘤球中SOX2、OCT4和c-Myc的表达水平显著高于普通培养的H446细胞;而H209肿瘤球中SOX2、NANOG和c-Myc的表达水平显著高于普通培养的H209细胞。3、致瘤实验显示,肿瘤球组的成瘤潜伏期短于普通培养细胞组,肿瘤生长速度比后者快,肿瘤体积较后者大。纵观各细胞数量级,H446肿瘤球或H209肿瘤球的成瘤率均明显高于普通培养的H446细胞或H209细胞。综上所述,通过无血清法从H446和H209细胞系中培养出的肿瘤球细胞具备CSCs的特性。因此,后文将H446肿瘤球细胞和H209肿瘤球细胞统一称为H446 CSCs和H209CSCs。第二部分As₂O₃对小细胞肺癌干细胞体外生长及皮下移植瘤的抑制作用1、与对照相比,As₂O₃可显著抑制H446 CSCs和H209 CSCs的增殖和克隆形成能力,呈浓度和时间依赖性。As₂O₃可显著抑制H446 CSCs和H209 CSCs在无血清培养条件下形成肿瘤球,且高浓度组的作用效果强于低浓度组。在撤药之后,As₂O₃对肿瘤球的抑制作用仍然存在。2、在H446 CSCs和H209 CSCs中,As₂O₃处理组的总凋亡率较对照组明显增加,且高浓度As₂O₃组的总凋亡率高于低浓度As₂O₃组。与对照相比,As₂O₃能上调凋亡效应蛋白PARP cleavage的表达,且高浓度组的上调效应更明显。但细胞周期分析显示,As₂O₃处理组的G0/G1期、S期和G2/M期细胞所占的比例与对照组比较无显著差异。3、与对照相比,As₂O₃能下调H446 CSCs和H209 CSCs中干细胞转录因子SOX2和c-Myc在蛋白水平的表达,且高浓度As₂O₃的下调效果更明显。4、用shSOX2和shNT感染H446 CSCs和H209 CSCs后细胞内可见明显的绿色荧光;shSOX2组中SOX2 mRNA的表达水平显著低于shNT组;与shNT组相比,shSOX2组形成肿瘤球的数量明显下降,肿瘤球的体积也明显缩小;shSOX2组中凋亡效应蛋白Caspase3 cleavage和PARP cleavage的表达量高于shNT组。5、与对照相比,As₂O₃能抑制H446 CSCs和H209 CSCs皮下移植瘤的生长。在干预结束时,As₂O₃处理组的平均肿瘤重量显著小于对照组,且5.0 mg/kg As₂O₃组移植瘤的平均重量低于2.5mg/kg As₂O₃组。TUNEL染色显示,As₂O₃处理组凋亡细胞的比例较对照组明显增加,且5.0 mg/kg As₂O₃处理组凋亡细胞的比例最高。免疫荧光染色显示,As₂O₃处理组中SOX2和c-Myc阳性细胞的比例较对照组明显下降,且5.0 mg/kg As₂O₃组中染色阳性细胞的比例最低。第三部分Hedgehog信号通路介导As₂O₃抑制小细胞肺癌干细胞的作用机制研究1、与对照相比,As₂O₃能下调H446 CSCs和H209 CSCs中GLI1蛋白及其靶基因PTCH1、n-Myc的表达,且高浓度As₂O₃的下调作用更明显。2、与对照相比,2.5mg/kg和5mg/kg As₂O₃干预能下调H446 CSCs和H209 CSCs移植瘤组织中GLI1蛋白及其靶基因PTCH1、n-Myc的表达,且5mg/kg As₂O₃的下调作用更明显。3、与对照相比,As₂O₃、GANT-61和联合给药均能显著抑制H446 CSCs和H209CSCs在无血清培养条件下形成肿瘤球;联合给药组形成肿瘤球的数量最少,显著少于单药组。与对照组相比,As₂O₃、GANT-61和联合给药组的总凋亡率明显增加,且联合给药组的总凋亡率高于单药组。与对照相比,As₂O₃、GANT-61和联合给药均能下调GLI1、SOX2和c-Myc蛋白的表达,且联合给药组的下调作用最明显。4、GANT-61能抑制H446 CSCs和H209 CSCs皮下移植瘤的生长。在干预结束时,GANT-61组的平均肿瘤重量显著小于对照组。TUNEL染色显示,GANT-61组移植瘤中凋亡细胞的比例较对照组明显增加。免疫荧光染色显示,GANT-61组移植瘤中SOX2和c-Myc阳性细胞的比例较对照组明显下降。【结论】1、通过无血清条件培养法可富集小细胞肺癌细胞系H446和H209中具有CSCs特征的细胞亚群。2、As₂O₃在体外和裸鼠体内均可抑制小细胞肺癌干细胞的生长,诱导显著的细胞凋亡,并下调干细胞转录因子SOX2和c-Myc的表达;SOX2敲减能抑制小细胞肺癌干细胞的生长,诱导细胞凋亡。3、As₂O₃在体外和裸鼠体内均对Hedgehog通路的关键转录因子GLI1蛋白及其下游基因PTCH1、n-Myc有明显的抑制作用;GLI抑制剂（GANT-61）能模拟并加强As₂O₃对小细胞肺癌干细胞的抑制作用（包括诱导凋亡以及下调SOX2和c-Myc）。上述结果提示,As₂O₃可能通过抑制Hedgehog通路的关键转录因子GLI1,下调SOX2和c-Myc蛋白,诱导细胞凋亡,从而抑制小细胞肺癌干细胞在体外和裸鼠体内的生长。