柑橘因其种类多样,口感丰富,在我国水果市场所占比例逐年上升。随着种植面积的不断扩大,柑橘对各种非生物胁迫适应性也需要加强。脯氨酸通过快速、大量积累响应逆境胁迫,维持植物体正常的生理代谢反应,其作用的发挥依赖于P5CS在整个代谢通路中的调节调控作用。为了进一步探究P5CS在不同胁迫下的表达,实验克隆了印度酸橘P5CS1,并进行生物信息学分析、基因表达模式探索,以及酵母单杂交、亚细胞定位、病毒诱导的基因沉默(VIGS)等功能研究。结果如下:1.利用生物信息学分析得到印度酸橘P5CS1序列包含713个氨基酸,其蛋白等电点为5.29,分子量为77430.25,属于亲水蛋白。根据氨基酸序列上发现的两个保守结构域构建分子进化树,结果显示印度酸橘P5CS1与甜橙的亲缘性最近。扩增得到P5CS1启动子,发现包含与干旱、光照、组织特异性表达相关的顺式作用元件,如ABRE,MYB,RY-element等。2.分析基因相对表达含量发现,P5CS在脱水、盐胁迫以及低温条件下,表达呈现先上升后下降的趋势。实验选择脯氨酸合成降解途径的三个关键酶基因P5CS,P5CR,Pro DH,施加上述三种胁迫并分析了它们在枳壳、印度酸橘、红橘三个柑橘品种中的表达趋势。发现P5CS表达趋势在不同胁迫下、不同品种中一致;P5CR在红橘中随胁迫时间延长,表达呈现先降低后上升的趋势。3.非生物胁迫中,脯氨酸含量的变化对盐胁迫更为敏感。在不同的胁迫处理时间节点,分别测定三个柑橘品种的脯氨酸含量,发现同一胁迫下,脯氨酸含量在三个品种中变化趋势较为一致,且对盐胁迫响应更为敏感。红橘在脱水和低温处理时脯氨酸含量较高,枳壳在盐胁迫下脯氨酸含量响应速度较慢但含量最高。综上所述,在枳壳、印度酸橘、红橘三种柑橘品种中,P5CS1调控的脯氨酸合成对盐胁迫响应更为准确。印度酸橘P5CS1启动子和基因全长结构功能的预测分析,也为后续实验展开提供了方向。