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目的探究脑出血急性期铁沉积介导的神经细胞铁死亡机制及动态变化过程,观察益气活血中药脑泰方对神经细胞铁死亡的干预作用及机制。方法第一部分:原代培养新生SD大鼠皮质神经元,采用血红蛋白(HGB)刺激模拟建立脑出血后神经元铁超载及过氧化损伤细胞模型;设正常组、模型组、空白血清对照组、铁离子螯合剂去铁胺(DFX)组、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)组和脑泰方含药血清(NTF)组。采用CCK8法检测各组细胞存活率,Calcein-AM染色法检测各组细胞内铁含量,ELISA法检测各组细胞谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX-4)含量及质活性氧(lipid-ROS)含量,采用高内涵细胞成像分析技术(HCA)检测各组细胞转铁蛋白受体(Tf R)、铁调节蛋白2(IRP-2)、膜铁转运蛋白1(Fpn-1)表达。第二部分:(1)采用自体血注射法构建SD大鼠脑出血模型,设正常组、假手术组、脑出血6小时组、脑出血24小时组、脑出血3天组、脑出血7天组,各组于相应时间点取材;(2)同法构建SD大鼠脑出血模型,设假手术组、模型组、DFX组、NAC组、脑泰方常规剂量(NTFC)组、脑泰方高剂量(NTFH)组,各组于造模并给药7d后取材;采用HE染色观察大鼠脑组织病理形态,Zea Longa5级评分法进行大鼠神经功能缺失评分,普鲁士蓝染色观察脑组织铁沉积,脑组织匀浆后生物试剂盒检测lipid-ROS、GSH含量;免疫组化及Western blot技术检测Tf R、IRP-2、Fpn-1、GPX-4及铁死亡标志物环氧合酶2(COX-2)的表达。结果(1)HGB刺激造模后神经元存活率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),细胞内铁离子含量、lipid-ROS含量、Tf R和Fpn-1表达显著升高,IRP-2表达、GSH及GPX-4含量显著降低(P<0.05,P<0.01)。经相应物质干预后,DFX组、NAC组和NTF组细胞存活率、GSH及GPX-4含量升高,细胞内铁离子含量、lipid-ROS含量显著降低(P<0.05,P<0.01);DFX组及NTF组细胞Tf R及IRP-2表达明显降低,Fpn-1表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。各组细胞内GSH含量与GPX-4含量呈显著正相关(r=0.992,P<0.05);GSH含量与lipid-ROS含量呈显著负相关(r=-0.996,P<0.05);lipid-ROS含量与铁离子含量呈显著正相关(r=0.859,P<0.05);lipid-ROS含量与细胞存活率呈显著负关(r=-0.991,P<0.05)。(2)经自体血注射造模后,假手术组大鼠神经功能缺失评分与正常组无显著差异;与假手术组比较,各脑出血模型组大鼠脑组织病理损伤逐渐加重,神经功能缺失评分逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);造模后24小时、第3天、第7天大鼠病灶脑组织铁沉积量、lipid-ROS含量及COX-2表达均明显升高,GSH和GPX-4含量明显降低(P<0.05,P<0.01);Tf R于造模后6小时、24小时表达明显升高,第3天表达低于24小时,第7天表达再次升高;IRP-2于造模后24小时表达明显降低,第3天表达进一步降低,第7天表达再次升高;Fpn-1于造模后24小时表达明显升高,第3天表达仍维持较高水平,第7天表达显著下降,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。(3)经DFX、NAC及NTFC、NTFH干预后,大鼠脑组织病理损伤均明显减轻,神经功能缺失评分均明显降低,脑组织GSH及GPX-4含量明显升高,铁沉积量、lipid-ROS含量及COX-2表达均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);NTFC组铁沉积量高于DFX组,而GSH、GPX-4、Lipid-ROS含量及COX-2表达与DFX组无显著差异;NTFH组铁沉积量高于DFX组,而其GSH、GPX-4含量高于DFX组,Lipid-ROS含量及COX-2表达低于DFX组(P<0.05,P<0.01);DFX对Tf R的调节作用优于NTFC和NTFH,NTFH对Fpn-1的调节作用优于DFX和NTFC;NTFC对GSH、GPX-4、Lipid-ROS、COX-2的干预作用弱于NAC,而NTFH对上述指标的干预作用与NAC无显著差异;NTFH组铁沉积量与NTFC组无显著差异,而其GSH含量高于NTFC组,Lipid-ROS含量及COX-2表达低于NTFC组,对大鼠脑组织病理损伤及神经功能缺失评分的改善作用均优于NTFC组,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论(1)脑出血后HGB降解导致神经细胞铁超载;铁超载介导神经细胞过氧化损伤导致铁死亡是脑出血急性期继发性脑损伤的病理机制。(2)脑出血急性期大鼠模型病灶脑组织铁沉积量逐渐升高,铁沉积使细胞抗氧化分子GSH和GPX-4耗竭,lipid-ROS累积而诱发神经细胞铁死亡,从而导致继发性脑损伤。(3)脑泰方可调节脑出血急性期神经细胞铁转运和调节蛋白的表达,并能提高神经细胞抗氧化分子的含量,从而减轻脑组织铁沉积和神经细胞过氧化损伤,抑制神经细胞铁死亡而发挥脑保护作用。(4)铁沉积并非神经细胞铁死亡的唯一因素,高剂量的脑泰方还可能通过其他靶点抑制神经细胞铁死亡而发挥脑保护作用。