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自噬是一种保守的分解代谢途径,其在清除受损细胞器、处理聚集的蛋白质、维持细胞动态平衡等过程中起着关键性的作用。自噬的过程主要分为以下阶段:自噬的诱导;自噬前体的形成;自噬体的成熟;自噬体与溶酶体融合,内容物降解。鉴于其中几个阶段已被广泛深入研究,本实验侧重于自噬体与溶酶体膜融合阶段的分子机制。SNAREs作为必需蛋白质在细胞膜融合的过程中发挥着重要作用,其可组装成一种反式SNARE复合体,即形成平行的四α-螺旋束以驱动膜融合。STX17是自噬体上的Qa-SNARE,VAMP8是溶酶体上的R-SNARE,研究表明在细胞实验中,STX17与VAMP8相互作用介导自噬体膜与溶酶体膜融合阶段。因此本实验使用纯化蛋白在体外实验中进一步验证两者的相互作用。首先应用生物学相关软件对STX17基因进行生物学分析,即预测和分析其氨基酸基本信息、编码蛋白的二级结构等相关信息。接着对重组质粒先转化后进行表达,主要从IPTG终浓度、诱导时间和诱导温度三个方面确定STX17融合蛋白的最优表达条件,纯化后的STX17蛋白经考马斯亮蓝染色、Western Blot进行鉴定。通过in vitro GST Pull down方法对纯化的STX17和VMP8蛋白的相互作用进行验证。本研究的实验结果显示:STX17的基因序列为909bp,编码303个氨基酸(终止子在内)。20种氨基酸中,碱性氨基酸占15.23%,酸性氨基酸占14.24%。含硫氨基酸(Cys、Met)有10个,显示该蛋白质存在二硫键。STX17编码的蛋白质在亲水与疏水区域交替出现,高疏水区域可能形成跨膜结构。二级结构中β转角(T)仅仅占5.17%,而α螺旋(H)为主导,占91.37%。蛋白最优表达体系为:IPTG终浓度0,2 mmol/L,诱导时间8h,诱导温度32℃。考马斯亮蓝染色和Western Blot结果显示pGEX-STX17表达的融合蛋白分子量在63 KD附近,经TEV酶切割目的蛋白,纯化好的蛋白分子量在37 KD附近。纯化出的STX17蛋白与VAMP8蛋白之间的相互作用明显。