组织工程角膜是近来兴起的一项非常有前景的治疗手段，其可克服供体角膜的缺乏和可能发生的免疫排斥反应等由传统角膜移植术所带来的局限。组织工程角膜构建最突出的问题是种子细胞的来源。由于目前大量体外培养获取人的角膜内皮细胞仍面临着许多困难。因此，尚需进一步寻找其他种类的细胞作为内皮细胞的替代细胞。人脐带间充质干细胞因获取方便、无创及避免了胚胎干细胞伦理学争议等优点，近年来被广泛的应用于临床研究。脐带间充质干细胞可分化为多种间叶组织细胞，其同时在组织和细胞替代治疗及再生医学方面具有极大的应用价值。众所周知，人类和啮齿类动物角膜内皮组织起源于神经嵴的眼周间叶组织。脐带间充质干细胞在体外可大量扩增并具有多向分化的潜能。因此，其是体外替代角膜内皮细胞的理想种子细胞来源。本研究中，我们通过共培养体系成功将人脐带间充质干细胞诱导分化成具有类似内皮细胞形态、标志物及功能特性的内皮样细胞。第一部分：人脐带间充质干细胞的体外分离、培养和鉴定目的：建立人脐带间充质干细胞分离、培养和鉴定的方法。方法：用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞，并置于37℃，5%CO2孵育箱中培养，待其贴壁传代后于倒置显微镜下行细胞形态学观察；流式细胞仪检测其表面抗原表型；碱性磷酸酶及茜素红染色鉴定其成骨诱导后的钙质沉积，油红O用于成脂诱导后脂滴染色观察。结果：我们利用胶原酶消化法成功分离培养出人脐带间充质干细胞，细胞表达多种抗原表型，如CD29, CD44, CD90和CD105，但不表达造血细胞及与移植排斥相关的抗原表型，如CD14, CD31, CD34, CD40, CD45和HLA-DR。在条件培养中可诱导分化为骨和脂肪细胞。结论：通过胶原酶消化法可成功分离培养出人脐带间充质干细胞；分离培养的脐带间充质干细胞具有间充质干细胞的抗原表型和具有多向分化的潜能。第二部分：兔角膜内皮细胞的体外分离、培养和鉴定目的：建立兔角膜内皮细胞分离、培养和鉴定的方法。方法：将带有角膜内皮细胞的后弹力层完整剥离后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合液于37℃，5%CO2孵育箱中行消化处理。待角膜内皮细胞贴壁传代后于倒置显微镜下行细胞形态学及HE染色观察。扫描电镜观察兔角膜内皮细胞的超微结构，免疫荧光及免疫组织化学染色鉴定其表面蛋白标志物ZO-1（紧密连接蛋白）和NSE（神经元特异性烯醇化酶）。结果：我们通过后弹力层揭除联合胰酶消化法成功分离培养出兔角膜内皮细胞。原代培养的兔角膜内皮细胞形态呈多边形，表面富含微绒毛，细胞间紧密连接，约10天后可融合形成铺路石样的外观。分离培养的兔角膜内皮细胞能够表达内皮细胞的蛋白标志物ZO-1和NSE。结论：通过后弹力层揭除联合胰酶消化法可成功分离培养出兔角膜内皮细胞，且其具有角膜内皮细胞所固有的特性。第三部分：共培养体系下诱导脐带间充质干细胞向角膜内皮样细胞分化的初步实验研究目的：通过与兔角膜内皮细胞行体外共培养，观察人脐带间充质干细胞是否能向角膜内皮样细胞诱导分化。方法：利用Transwell共培养体系，将人脐带间充质干细胞与兔角膜内皮细胞进行共培养，诱导分化7天后的细胞行倒置显微镜和原子力显微镜下观察形态。CCK-8检测诱导分化细胞的增殖活性，实时荧光定量PCR和Western blot检测诱导分化细胞的相关内皮细胞的标志物蛋白（紧密连接蛋白、神经钙黏素和神经元特异性烯醇化酶）及特异性转录因子（FoxC1和Pitx2）的表达情况。结果：共培养诱导分化后细胞的增殖、周期及凋亡与诱导前相比无明显差异。与兔角膜内皮细胞共培养7天后，纺锤形的脐带间充质干细胞已逐渐向卵圆形和多角形的细胞形态转变，且能够表达内皮细胞相对特异性的标志物蛋白（ZO-1、N-cadherin和NSE）及相关转录因子（FoxC1和Pitx2）。结论：通过与兔角膜内皮细胞共培养后，人脐带间充质干细胞可被诱导分化为角膜内皮样细胞。