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粉红螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea）是一类重要的生防真菌,可以防治灰霉菌、核盘菌、立枯丝核菌等多种植物真菌病害,具有很强的生防潜力。目前真菌制剂多为分生孢子制剂,稳定性较差,货架期短。厚垣孢子是真菌在特定条件下产生的一种抗逆结构,对真菌生防制剂的研发具有重要意义,但迄今关于生防真菌厚垣孢子形成相关基因的研究极少。为筛选粉红螺旋聚孢霉产厚垣孢子相关基因,本研究以实验室前期分离的粉红螺旋聚孢霉高效菌株67-1为材料,通过高通量测序获得粉红螺旋聚孢霉67-1菌株产厚垣孢子转录组,筛选出不同产孢条件下稳定表达的适宜内参基因,并通过基因敲除,证明己糖激酶基因、聚酮化合物羟化酶基因和醛脱氢酶基因在粉红螺旋聚孢霉67-1菌株厚垣孢子形成过程中的作用,为揭示厚垣孢子形成机制奠定了基础。为获得粉红螺旋聚孢霉67-1菌株产厚垣孢子相关基因,本实验以粉红螺旋聚孢霉67-1菌株为材料,分别在36 h和72 h取样,通过高通量测序技术和实时荧光定量PCR获得粉红螺旋聚孢霉67-1菌株产孢差异表达基因。转录组分析获得549,661,174 clean reads。36 h时有67个基因上调表达,117个基因下调表达;72 h时有53个基因上调表达,24个基因下调表达。GO分类注释差异表达基因与细胞组分、生物学过程和分子功能相关。KEGG分析表明,共有188条代谢途径参与了粉红螺旋聚孢霉67-1菌株厚垣孢子的形成过程,主要包括次级代谢生物合成和环境代谢途径。对16个差异表达基因进行实时荧光定量PCR检测,表达水平的变化与转录组分析一致。内参基因是基因表达水平准确定量的基础。为筛选粉红螺旋聚孢霉67-1菌株产厚垣孢子条件下稳定表达的内参基因,选取9个管家基因—肌动蛋白（ACT）、延伸因子1（EF1）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、泛素（UBQ）、泛素结合酶（UCE）、组氨酸（HIS）、RNA聚合酶II CTD磷酸酶Fcp1（RPP）、TATA结合蛋白（TBP）和琥珀酸-半醛脱氢酶（SSD）,利用实时荧光定量PCR检测这些基因在粉红螺旋聚孢霉67-1菌株产厚垣孢子过程中的表达水平,并通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个内参软件分析候选基因的表达稳定性。最终筛选出SSD和ACT组合作为内参基因用于定量粉红螺旋聚孢霉67-1菌株在产厚垣孢子过程中的基因表达。通过转录组分析结果,分离获得己糖激酶基因HXK67、聚酮化合物羟化酶基因PKH67和醛脱氢酶基因ALD67。实时荧光定量PCR显示,与对照相比,在36 h和72 h,HXK67表达量分别升高1.8倍、89.1倍,PKH67表达量分别升高11.8倍、25.3倍,ALD67表达量分别升高16.1倍、9.8倍。三个基因生物信息学分析结果显示,HXK67编码区总长1602 bp,编码533个氨基酸,与顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）的己糖激酶相似蛋白同源性为63%。PKH67编码区总长1716bp,编码571个氨基酸,与胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）中的聚酮化合物羟化酶同源性为61%。ALD67编码区总长975 bp,编码324个氨基酸,与胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）中的醛脱氢酶同源性为49%。用同源重组方法构建HXK67、PKH67和ALD67的敲除载体,并用PEG4000-CaCl2介导原生质体转化的方法成功得到HXK67的缺失突变株ΔHXK67,突变株ΔHXK67的生长速率较野生菌株显著性提高,但产厚垣孢子能力和对尖孢镰刀菌的拮抗能力无显著差异。