研究目的:心力衰竭（Heart Failure）是多种疾病发展到终末阶段的共同结果,因为其较高的发病率和死亡率,如今已经成为主要的医疗保健负担。在高血压等血流动力学压力的影响下,心肌细胞代偿性肥大,心肌细胞进行性的流失导致心力衰竭。近年来,随着组学研究的进展,对心力衰竭的发病机制有了新的认识。明确心力衰竭的分子学机制,不仅有助于寻找新的血清标志物,而且还可以发现新的治疗靶点,服务临床。随着高通量测序技术的发展,多项研究发现非编码RNA在心力衰竭的发生发展中扮演着重要角色。环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA,其环形结构和缺少5’端帽子以及3’端poly A尾的特殊结构使其拥有比线性RNA更稳定的性质。研究发现,circRNA在肿瘤和重要脏器缺血再灌注损伤中发挥重要的调控作用。此外,在心脏形成过程中,circRNA的表达也具有时间和空间特异性。因此对心力衰竭过程中circRNA的表达模式的研究可能为治疗心力衰竭提供新的靶点。在众多导致心肌收缩功能障碍的因素中,心肌细胞数量的减少是重要原因之一。而在心衰时心肌细胞数量的减少主要见于心肌细胞死亡和凋亡。铁死亡是近年新发现的一种细胞死亡方式,主要特点是铁依赖的细胞脂质过氧化物积累。铁死亡是基因调控的细胞死亡方式,但是心肌细胞铁死亡在心力衰竭中的作用鲜有研究。本项研究旨在通过生物信息学手段筛选心力衰竭过程中可能参与铁死亡的差异基因,并通过转录组数据和非编码RNA数据库预测基因间的相互作用,通过调控circRNA来减少心肌细胞的铁死亡,从而达到改善心功能的目的,为治疗心衰提供新的靶点。研究方法:1、本研究通过主动脉弓缩窄术（TAC）诱导C57BL/6小鼠心力衰竭,使用心脏超声检查小鼠左室射血分数、左室缩短分数、左室内径和容量等指标评估小鼠心功能。测量小鼠的体重、心脏重量和胫骨长度评价其心衰状态。对小鼠心脏进行HE、Masson和WGA染色以及血清学指标（ANP、NT-pro BNP）检测评估造模后小鼠心脏损伤和纤维化程度。比色法检测心力衰竭小鼠心脏组织中丙二醛,谷胱甘肽和亚铁离子的含量,免疫组化和Western Blot检测与铁死亡相关的标志蛋白（GPX4、ACSL4、NOX1、FTH1）的表达量,评估小鼠心肌细胞铁死亡程度。借助在线数据库（GEO、Proteome Xchange、PUBMED）对转录组和蛋白质质谱分析数据重分析,筛选出与铁死亡相关的差异蛋白和非编码RNA。通过Target Scan、Star Base和Reg RNA 2.0数据库,预测这些基因间的相互作用,绘制竞争性内源性RNA（ceRNA）调控网络。qRT-PCR、免疫组化和Western Blot对所预测的基因及蛋白进行验证,确定其表达水平与心力衰竭的相关性。2、本研究中构建circSnx12过表达和沉默腺病毒载体,感染HL-1细胞和小鼠心肌组织来评价circSnx12对心肌细胞铁死亡的调控作用。通过CCK8实验确定了Erastin诱导HL-1细胞铁死亡的浓度。比色法检测HL-1细胞中丙二醛和总谷胱甘肽含量评价经过Erastin诱导的HL-1细胞对铁死亡的敏感性。在体内实验中,将腺病毒以心肌原点注射的方式感染小鼠心脏组织,再进行TAC手术,利用小动物活体成像和qRT-PCR技术评价腺病毒感染小鼠心肌的效率。心脏超声检测小鼠射血分数、缩短分数、左室内径和容量等指标评价小鼠心功能。HE、Masson染色和血清学指标（ANP、NT-pro BNP）检测circSnx12对小鼠心肌损伤的影响。比色法检测小鼠心脏组织中丙二醛、谷胱甘肽和亚铁离子含量,免疫组化和Western Blot检测相关铁死亡指标（GPX4、ACSL4、NOX1、FTH1）评价circSnx12对小鼠心肌细胞铁死亡调控作用。3、基于前期对差异基因的筛选和验证,应用免疫荧光原位杂交技术对circSnx12进行定位,RNA免疫沉淀实验验证circSnx12和miR-224-5p与AGO2蛋白间的相互作用。双荧光素酶报告基因实验检测circSnx12与miR-224-5p和miR-224-5p与FTH1之间的相互作用。在体内实验中,应用miR-224-5p沉默腺病毒载体在体注射方式感染小鼠心肌后手术诱导心衰。通过心脏超声,病理染色和血清学检测方式评价小鼠心脏损伤,丙二醛、谷胱甘肽和亚铁离子含量和铁死亡相关蛋白指标评价小鼠心肌细胞铁死亡情况。在体外通过miR-224-5p和circSnx12共感染HL-1细胞,检测丙二醛和总谷胱甘肽含量评价miR-224-5p能否恢复circSnx12对Erastin诱导的HL-1细胞铁死亡的影响。验证circSnx12调控心肌细胞铁死亡的作用机制。研究结果:1、TAC术后小鼠心功能降低,出现明显的心肌损伤和纤维化。与对照组相比,其血清中ANP和NT-pro BNP含量明显升高。生化检测发现TAC手术后,小鼠心脏组织中丙二醛和亚铁离子含量明显升高,谷胱甘肽含量明显降低,同时Western Blot和免疫组化提示ACSL4、NOX1表达明显升高,GPX4表达下调,提示TAC可以诱导小鼠心肌细胞铁死亡。基于生信筛选结果绘制ceRNA调控网络。选择差异表达丰度较大的ATP6V1A和FTH1以及可能与其相互作用的5个miRNA和7个circRNA并绘制了ceRNA调控网络。应用qRT-PCR、Western Blot和免疫组化检测发现FTH1在心力衰竭中表达明显下调,与质谱分析结果相符,并且和可能与其相互作用的circSnx12和miR-224-5p表达具有相关性。2、体外实验中,circSnx12过表达后,与Erastin组相比,HL-1细胞内丙二醛含量明显降低,总谷胱甘肽含量升高,与对照组相比,circSnx12沉默对HL-1细胞内丙二醛和总谷胱甘肽含量影响不显著。体内实验发现,circSnx12过表达对小鼠心脏功能有明显保护作用,左室射血分数和缩短分数较TAC组明显升高,心肌组织损伤和纤维化以及心肌细胞铁死亡程度明显减轻。3、免疫荧光原位杂交发现circSnx12定位于HL-1细胞质。RNA免疫沉淀实验证实了circSnx12和miR-224-5p可以与AGO2蛋白结合,确定了其ceRNA的作用基础。双荧光素酶报告基因显示miR-224-5p可以显著降低野生型circSnx12载体和野生型FTH-1-UTR载体的荧光强度,而对突变型载体的荧光强度无影响。此外,miR-224-5p过表达可以抵消circSnx12过表达对Erastin诱导的HL-1细胞铁死亡的保护作用。体内实验发现,沉默miR-224-5p后行TAC手术结果与circSnx12过表达组对小鼠心功能保护作用相似,降低心肌细胞对铁死亡的敏感性。研究结论:1、TAC手术可以导致小鼠心肌细胞铁死亡,诱导小鼠心力衰竭。circSnx12和FTH1在心力衰竭小鼠心肌组织中表达下调,而miR-224-5p表达上调。表明circSnx12、miR-224-5p和FTH1的表达与心力衰竭具有相关性。2、circSnx12过表达可以保护心肌细胞,降低心肌细胞对铁死亡的敏感性。3、miR-224-5p过表达可以抵消circSnx12过表达对心肌细胞铁死亡的保护作用。circSnx12通过与FTH1竞争结合miR-224-5p从而维持细胞内铁代谢稳态,调控心力衰竭小鼠心肌细胞的铁死亡。