第一章：大鼠角膜移模型的建立和排斥反应相关蛋白组学分析目的建立大鼠自体移植模型和异体移植模型,通过同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)为基础的蛋白质组学研究筛选出与角膜移植排斥发生、发展相关的差异蛋白,并运用生物信息学技术,分析其与角膜移植排斥反应可能相关的机制,为进一步发展新的排斥反应监测、预防、治疗手段奠定基础。材料和方法1.成年Wistar大鼠42只,随机分为三组,分别对右眼行同种异基因角膜移植(SD大鼠为供体,Wistar大鼠为受体),同种同基因角膜移植(自体原位角膜移植)及空白对照。2.术后每天观察植片水肿、浑浊和新生血管情况。3.术后2、7、14天收集各组大鼠泪液,每只约10μ1,冻存于80℃以备后用。4.将大鼠泪液样本离心后取上清液,经多重吸附去除系统(MARS)去除高丰度蛋白。然后对这些泪液标本进行蛋白提取、定量和酶解。5. iTRAQ八标试剂标记后(113标记空白对照组,115标记异体移植组2d,116标记异体移植组7d,117标记异体移植组14d,118标记自体移植组2d,119标记自体移植组7d,121标记自体移植组14d),进行二维液相色谱-串联质谱(2DLC-MS/MS)分析。6.利用ProteinPilot软件进行搜库并定量。差异表达蛋白界值设定：大于2为显著上调(p<0.05),小于0.5为显著下调(p<0.05)。7.观察各组间蛋白表达的差异和各组内不同时间点蛋白表达的差异。对各组和各时间点差异表达的蛋白进行生物信息学分析,包括分层聚类分析、G0分析和通路分析,寻找角膜移植排斥反应相关的差异蛋白。结果1.角膜移植术后,除术后2天两组大鼠角膜植片浑浊度没有统计学差异外(p=0.123),其余角膜植片在各时间点浑浊、水肿、新生血管及RI值差异有显著性(p<0.05)。2.共鉴定出iTRAQ标记的差异蛋白277个。在异体移植组中2d、7d、14d这三个时间点发生显著上调/下调的蛋白分别为：35个、36个、31个。3.在异体移植组中,G0分析发现神经系统调节、自由基的清除、细胞的死亡与存活、细胞运动富集度较高；pathway分析显示LXR/RXR的活化、急性时相反应信号通路、网格蛋白介导的内吞作用信号通路和肌动蛋白细胞骨架信号通路富集度较高。与自体移植相比,异体移植富集度显著增高的通路有：LXR/RXR的活化通路、网格蛋白介导的内吞作用信号通路。4. Coronin-1A在异体移植组中明显高于自体移植组。在异体移植组中,其在排斥开始发生时即7d达到峰值,而在自体移植组中,其随时间推移逐渐降低。5. Vitamin-D binding protein(DBP)在移植组第14天明显上调。结论1. Itraq为我们从整体上了解角膜移植排斥发生、发展过程中蛋白质的差异表达,从而筛选出有意义的蛋白提供了良好的平台。对样本量小、极性蛋白、及酸性碱性蛋白具有很高的检出率,可信度高,可重复性强。泪液样本的收集对眼局部和全身无影响。由于泪液样本量较少,选用itraq技术对泪液中蛋白质的检测具有很高的效率。2.生物信息学的方法可以扩展思路和视野,有助于我们进一步从整体上了解差异表达蛋白的功能和调控。本研究提示参与神经系统调节的蛋白与植片的排斥相关,而参与氧自由基的活化的蛋白与角膜内皮细胞凋亡以及白细胞积聚、免疫损伤和新生血管的形成相关。LXR/RXR通路可能通过影响脂质代谢、葡萄糖代谢和巨噬细胞相关基因表达影响植片的存活。肌动蛋白细胞骨架信号通路参与免疫细胞的趋化移行、抗原识别、信号转导、免疫突触形成、活化、增殖分裂等过程,从而影响免疫排斥反应。3. Coronin-1A可能是排斥发生早期有意义的生物学标记物,它通过影响T细胞的迁移和T细胞与APCs相互作用参与排斥反应的发生。4.DBP可能通过影响巨噬细胞活化和趋化参与角膜移植排斥反应。第二章抗排斥药物干预对于角膜移植排斥反应相关蛋白表达的影响目的通过iTRAQ蛋白组学技术,观察抗排斥药物地塞米松和环孢素(CsA)对大鼠角膜移植模型泪液中蛋白质的影响,并运用生物信息学技术,分析差异表达的蛋白在角膜移植排斥发生、发展中的作用机制。方法1.成年Wistar大鼠28只,随机分为2组,对右眼行同种异基因角膜移植(SD大鼠为供体,Wistar大鼠为受体)。术后两组分别给予地塞米松眼水和CsA眼水,观察植片排斥情况。空白对照组wistar大鼠14只。2.术后2、7、14天收集各组大鼠泪液,每只约10μl,冻存于80℃以备后用。3. iTRAQ八标试剂标记(114标记对照组；115标记环孢素2d；116标记环孢素7d；117标记环孢素14d；118标记地塞米松2d；‘119标记地塞米松7d；121标记地塞米松14d)。其余操作同第一章。结果1.用药组除第2天外,其他时间点RI均低于未用药组。地塞米松组和CsA组之间RI无明显差异。2.共鉴定出iTRAQ标记的差异蛋白440个。3.地塞米松组2天、7天、14天这三个时间点发生显著上调／下调的蛋白分别为：36个、41个、9个。4.环孢素组2天、7天、14天这三个时间点发生显著上调／下调的蛋白分别为45个、49个、43个。5.对地塞米松组进行GO分析发现细胞的死亡与存活,皮肤疾病,蛋白合成,神经系统疾病等有关的生物学过程富集程度较高,pathway分析显示显示EIF2信号通路、LXR/RXR活化信号通路、网格蛋白介导的内吞作用信号通路、急性期反应信号通路富集度较高。与未用药移植组相比,LXR/RXR活化信号通路、网格蛋白介导的内吞作用信号通路、急性期反应信号通路和肌动蛋白细胞骨架信号通路均有不同程度的下降。6.对环孢素组进行G0分析发现细胞的死亡与生存、蛋白合成、皮肤疾病、免疫性异常等富集度较高, pathway分析显示显示LXR/RXR活化通路、EIF2信号通路、网格蛋白介导的内吞作用信号通路、急性期反应信号通路富集度较高。与未用药移植组相比,网格蛋白介导的内吞作用信号通路、急性期反应信号通路、肌动蛋白细胞骨架信号通路的富集度均有不同程度下降。7. coronin-lA上调的程度明显低于未用药组(未用药组：2d=5.75,7d=8.24,14d=4.29；地塞米松组：2d=5.86,7d=1.63,14d=1.55; CsA组：2d=3.80,7d=3.40,14d=3.02)。8.DBP在用药组显著低于未用药组。结论1.EIF2信号通路可促进角膜内皮细胞的一些损伤修复机制,从而使其能够更好的跨过细胞阻滞,抵抗凋亡。2.急性时相蛋白与角膜移植排斥的发生密切相关。与未用药组相比,其在用药组中明显降低,提示急性时相反应蛋白还与与排斥的程度相关,因此,泪液中的急性时相蛋白可能可作为植片排斥的检测指标,指导临床的早期诊治和检测疗效。3.抗排斥药物可能通过降低coronin-1A的表达,影响T细胞的迁移和T细胞与APCs相互作用,从而减轻角膜移植排斥反应。4.抗排斥药物干预对于DBP有明显影响,可以考虑DBP作为评价角膜移植术后预后的指标。第三章人泪液中角膜移植排斥反应相关蛋白筛选及临床应用初探目的应用iTRAQ蛋白质组学技术,对临床PKP术后发生角膜移植排斥反应和未发生角膜移植排斥反应病人泪液中的蛋白质组进行检测,以求在动物模型的基础上,进一步深入研究探索角膜移植排斥的发生机制,并发现新的生物学标记物,为排斥发生的早期诊治和新药的开发提供新思路。材料与方法1.穿透性角膜移植术后,发生急性排斥的患者10例,简称排斥组,收集其泪液；穿透性角膜移植术后(>2周)未发生排斥的患者10例,简称未排斥组。排斥组和未排斥组术后按常规局部或全身使用糖皮质激素、环孢素A以预防术后排斥。2.排斥组患者在临床诊断为角膜移植排斥反应时收集基础泪液,未排斥组于术后>2周采集。泪液样本置于-80℃保存。3. iTRAQ四标标记：117未排斥组；121排斥组。差异表达蛋白界值设定：大于1.3为显著上调(p<0.05),小于0.77为显著下调(p<0.05)。其余操同第一章相关内容。4.利用Ingenuity生物通路分析软件分析所鉴定蛋白间的交互作用。结果1.发生排斥的10例患者中,包括4名角膜白斑、3名病毒性角膜炎、1名真菌性角膜炎、1名角膜穿孔和一名未规律用药的圆锥角膜。2.共鉴定出iTRAQ标记的蛋白428个。显著变化的差异蛋白7个,上调的有丛生蛋白(Clustering)、富含脯氨酸蛋白4(proline-rich protein4)和α-淀粉酶2B (a-amylase2B),下调的有脂钙蛋白-1(lipocalin-1)、细胞外糖蛋白(extracellular glycoprotein lacritin)、血清白蛋白(serum albumin)和转录因子7(transcription factor7-like1).3.G0分析结果显示细胞间的相互作用、cell compromise、器官损伤和异常等功能的富集度较高；pathway分析显示LXR/RXR活化信号通路、原发免疫缺陷信号通路和急性期反应信号通路的富集度较高。4.IPA分析发现尽管泛素结合酶(ubiquitin conjugation enzyme, UBC)未被iTRAQ检测出,但是UBC与多种鉴定出的角膜移植排斥相关蛋白发生作用。结论1.角膜移植排斥发生的高危因素主要包括炎症、角膜新生血管化、角膜新生淋巴管化、反复移植、大植片或不规则植片、感染和病毒复制(主要见于单疱病毒性角膜炎)。此外,即使在低危病人中,如不规律用药,排斥风险也会明显升高。2.丛生蛋白、富含脯氨酸蛋白4、α-淀粉酶2B和脂钙蛋白-1可能为角膜移植排斥反应的生物学标志物。3.泛素结合酶(UBC)可能为多种排斥相关蛋白的上游分子,通过调控下游目标蛋白参与角膜移植排斥反应发生、发展的过程。