基于组学技术的鱼类病原性气单胞菌致病机理研究

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高通量测序技术对于生物学研究来说是一次飞跃性的提高。测序通量大、周期短和测序成本的降低,为测序技术的普及、平民化提供了可能。现在高通量测序技术已经被广泛应用到动植物育种及人类疾病研究中,不久的将来,它或许将渗透到我们生活的方方面面,影响并改变我们的学习和生活。  本论文针对气单胞菌属中的杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌,利用组学技术开展致病机理和鱼类抗感染机制的研究。  杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)属于变形菌门,气单胞菌科,气单胞菌属,为革兰氏阴性短杆菌,不具运动性。杀鲑气单胞菌主要引起鱼类感染发生疖疮病,对经济价值较高的鲑科鱼类危害严重。目前已有许多关于杀鲑气单胞菌感染的报道,但其主要感染对象多为海洋鱼类,感染淡水鱼类的情况较少见。本研究分别于2012年3月末、2013年10月从长江与黄河网箱养殖的患病圆口铜鱼和高白鲑中分离到杀鲑气单胞菌。长江与黄河是我国两大主要内陆淡水河流,且圆口铜鱼与高白鲑是我国的重要经济鱼类,因此对分离到的两个菌株进行深入研究显得意义深重。  由杀鲑气单胞菌引起的疖疮病是鲑科鱼类的一种流行性疾病,其中包括虹鳟。虽然国内外已有许多与虹鳟疾病相关的研究,但虹鳟抗杀鲑气单胞菌感染的分子机制依然不是十分清楚。转录组学与蛋白质组学是研究机体分子机制常用的方法,且二者的联合分析越来越广泛地应用于各个研究领域。因此本研究对杀鲑气单胞菌感染虹鳟前后的脾脏组织进行转录组与蛋白质组测序,以期找到与病原菌感染相关的基因或蛋白,为鱼类的进一步免疫学研究提供新的分子标识物。  嗜水气单胞菌是我国养殖鱼类最重要的病原菌之一,能引起多种水产养殖动物多种不同疾病,根据症状的不同可分为运动型气单胞菌败血症(MAS),运动型气单胞菌感染(MAI),出血性败血症,溃疡性综合症(EUS)等。作为鱼类和贝类疾病的病原,嗜水气单胞菌虽被广泛分离鉴定与研究,但对嗜水气单胞菌的致病机理仍缺乏系统研究。本研究通过对嗜水气单胞菌在白鲢体外血清与基础营养培养基(BHI)中生长的条件下进行转录组与蛋白质组测序,以期为细菌致病关键因子的筛选提供重要线索与可能。主要研究成果如下:  1.分别于2012、2013年4月从长江网箱养殖的圆口铜鱼、2013年10月从黄河网箱养殖的高白鲑中分离到致病菌,通过形态学观察、生理生化特性分析、16S rRNA序列和vapA基因高变区序列的系统发育分析将两株菌鉴定为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种,并命名为YK与BG,这是首次从非鲑科(鲤科)、淡水鱼类中分离到杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。毒力试验证明相同条件下BG毒力远大于YK。考虑到分离地区、分离宿主的独特性以及毒力大小的差异性,我们对两株分离菌进行了基因组测序,这是首次对分离自中国地区的杀鲑气单胞菌进行基因组测序研究。结果发现两株菌的基因组序列中含有许多可变元件,包括基因岛(GEI)、Tn7转座子、噬菌体以及插入序列(IS),通过对这些可变序列片段进行分析,发现它们中有些(如GEI、Tn7)可能作为中国地区杀鲑气单胞菌的区域标识物,有些(IS)可对菌株的毒力大小产生影响,有些(Tn7)所含有的分子片段可作为菌株的潜在毒力因子。  2.虹鳟感染杀鲑气单胞菌前后脾脏组织的转录组与蛋白质组测序。通过对测序结果进行分析,共得到1036个差异表达基因和133个差异表达蛋白;差异表达基因与蛋白的GO、KEGG富集分析结果显示免疫系统过程为显著富集的GO条目和通路,其中补体途径和细胞因子互作途径为免疫系统过程中发挥重要作用的途径或通路;转录组与蛋白质组学结果联合分析发现了17个一致性差异表达基因/蛋白,包括11个上调表达蛋白和6个下调表达蛋白;11个上调表达蛋白中有8个为免疫相关蛋白,可能作为虹鳟对抗病原菌感染的免疫标识物分子。  3.嗜水气单胞菌在白鲢体外血清与基础营养培养基中生长时的细菌转录组与蛋白质组测序,鉴定了差异表达的基因与蛋白。结果共得到946个显著差异基因和931个显著差异蛋白,其中有287个共同差异基因/蛋白,208个一致性差异蛋白。差异表达基因与蛋白的GO、KEGG富集分析发现硫化合物的代谢是显著富集的GO条目、KEGG通路。硫化合物代谢通路中的4个一致性差异蛋白均下调表达,因此我们认为在血清中,细菌的硫化合物代谢受到抑制。本研究通过数据分析得到了几个与嗜水气单胞菌在血清中生长显著相关的基因,为嗜水气单胞菌在适应白鲢血清生长中的整体基因调控和相互作用提供了新的参考。
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