如何减轻脑、脊髓缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）损伤是一个亟待解决的世界医学难题。缺血耐受现象的发现为缺血损伤保护研究开辟了新途径和新思路。研发简便有效、副作用小非缺血预处理措施，已成为研究热点。本实验室率先提出及证实“电针预处理”的概念，为减轻脑、脊髓缺血损伤和电针研究开辟新途径。虽然，我们一直致力电针预处理诱导脑、脊髓缺血耐受机制的研究，但电针预处理机制远未阐明，仍需从新角度、新通路和新信号分子做进一步深入研究。研究一以谷氨酸转运体(ExcitatoryAminoAcid Transporters， EAATs)为切入点，探讨EAATs在电针预处理“百会穴”诱导大鼠脑缺血耐受中的作用及机制。谷氨酸（Glutamate，Glu）是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，对维持正常脑功能至关重要。由于胞外不存在谷氨酸代谢酶系统，中枢神经系统的Glu浓度，主要依赖神经细胞和神经胶质细胞上谷氨酸转运体精确调控。近年研究表明，脑缺血后释放大量谷氨酸是导致脑I/R损伤的重要机制。EAAT2、EAAT3损伤与神经保护之间存在密切联系。然而，EAATs作为重要保护蛋白是否参与电针预处理诱导的神经保护作用有待明确。本研究旨在探讨电针预处理对EAATs的表达是否有影响，EAATs表达是否具有脑区特异性（皮层、海马）。采用EAAT3-/-小鼠和EAAT2特异性拮抗剂，进一步观察，是哪种EAATs（EAAT1、EAAT2、EAAT3）在电针预处理后发挥主要的保护作用，以阐明电针预处理诱导脑缺血耐受的关键机制。为临床应用电针预处理防治脑I/R损伤提供实验与科学理论依据。研究二以高迁移率族蛋白B1(High Mobility Group Box Protein1, HMGB1)为切入点，探讨HMGB1在电针预处理“足三里”诱导大鼠脊髓缺血耐受中的作用及机制。免疫炎性反应是导致迟发性截瘫发生的主要原因。如何调控炎症细胞激活和炎性因子释放，已成为减轻I/R损伤一个非常重要的环节。HMGB1又被称为晚期炎性因子，因其结构和功能的特殊性，它在中枢神经系统的I/R损伤的作用倍受关注。研究已证实，缺血后HMGB1被大量被动分泌到细胞外，作为晚期关键的“损伤信号”参与I/R损伤。现已明确，针灸“足三里”可调节机体免疫、抑制炎症反应，降低急性脑梗塞患者血清TNF水平。由于炎症反应是I/R后造成晚期中枢神经系统损伤主要机制。据此我们推测：电针预处理通过抑制晚期关键“损伤信号”HMGB1表达和分泌，继而阻断免疫炎症的级联反应，发挥其长时程的神经保护作用。由于以往研究仅观察到再灌注后72h的电针脊髓保护效应，缺乏对其的长时程保护效应及机制研究。针对临床上迟发性截瘫的特点，本研究旨在探讨重复电针刺激“足三里”脊髓的长时程保护效应和机制，进而回答电针预处理是真正抑制神经元损伤，而不是延迟神经元损伤这个关键问题。在此基础上，明确HMGB1转录和翻译水平下调是重复电针预处理诱导脊髓保护的关键机制。第一部分EAATs在重复电针预处理诱导脑保护的作用及机制实验一重复电针预处理对EAATs表达的影响目的：探讨重复电针预处理对EAATs在不同脑区表达的影响。方法：雄性SD大鼠（280-320g），随机分为4组（n=5）：①空白对照组(Control)：吸氧（30min，5d）；②戊巴比妥组(PB)：戊巴比妥钠(40mg/kg，ip，5d)；③电针旁开组(PEA)：“百会穴”旁开1cm，重复电针刺激（1mA，2/15Hz，30min/d，5d）；④电针组(EA)：“百会穴”重复电针刺激（1mA，2/15Hz，30min/d，5d）。最后一次处理24h后处死动物。Western Blot定量检测EAAT1、EAAT2、EAAT3蛋白在皮层和海马表达。结果：与Control组相比，电针组EAAT2在皮层的表达显著上调（P<0.05），EAAT3在海马的表达有增高趋势（(P=0.158），EAAT1在皮层和海马表达无明显差异（P>0.05）。结论：重复电针预处理主要上调皮层EAAT2表达水平。提示电针预处理可影响EAATs表达，但具有脑区特异性。实验二EAAT2在电针预处理诱导脑保护的作用目的：探讨EAAT2在电针预处理诱导脑保护的作用。方法：（1）EAAT2在电针预处理诱导脑保护的作用：雄性SD大鼠（280-320g），随机分为6组（n=8）：①对照组(Control)；②戊巴比妥组(PB)：戊巴比妥钠(40mg/kg，ip)；③电针旁开组(PEA)：“百会穴”旁开1cm，重复电针刺激（1mA，2/15Hz，30min/d，5d）；④电针处理组(EA)：重复电针预处理（百会穴，1mA，2/15Hz，30min/d，5d）；⑤DHK组：MACO前30min，给予DHK(10mg/kg，ip)；⑥DHK+EA组：重复电针预处理（百会穴，1mA，2/15Hz，30min/d，5d），MACO前30min，给予DHK(10mg/kg，ip)。最后一次处理后24h，采用MCAO方法致右侧大脑中动脉栓塞模型。再灌注后48h行神经功能缺陷评分（Neurological Deficit Scores，NDS）评分和2,3,5一氯化三苯四氮唑染色（2,3,5-triPhenyltetrazolinmehlorid，TTC）。（2）电针预处理对再灌注后EAAT2表达的影响：雄性SD大鼠，随机分为3组（n=4）：①对照组(Control)；②模型组(MCAO)；③电针组(EA+MCAO)：重复电针刺激（百会穴，1mA，2/15Hz，30min/d,5d），最后一次处理24h后行MCAO。再灌注48h后，Western Blot检测EAAT2的蛋白表达水平。结果：（1）EAAT2在电针预处理诱导脑保护的作用：与Control组相比，电针可显著降低NDS评分，减少脑梗死容积（P<0.05）。给予EAAT2拮抗剂DHK后，能逆转电针诱导的脑保护（P<0.05）。单独给予DHK，可显著增加NDS评分和脑梗死容积（P<0.05）。 PEA组、PB组和对照组之间，NDS评分和脑梗死容积无明显差异（P>0.05）；（2）电针预处理对再灌注后EAAT2表达的影响：与MCAO组相比，再灌注后48h电针预处理可明显上调EAAT2在皮层的蛋白表达水平(P <0.05)。结论：重复电针预处理可诱导脑保护，并上调再灌注后EAAT2在皮层的蛋白表达水平，EAAT2抑制剂DHK可逆转电针预处理的神经保护作用。实验三EAAT3在电针预处理诱导脑保护的作用目的：观察EAAT3在电针预处理诱导脑保护的作用。方法：（1）电针预处理对EAAT3-/-小鼠诱导脑保护的研究： EAAT3-/-小鼠（25-30g），随机分为2组（n=8）：①MCAO组：MCAO模型；②EA+MCAO组：重复电针预处理（百会穴，1mA，2/15Hz，30min/d，5d），最后一次处理24h后行MCAO，再灌注后24h行NDS评分和TTC染色。（2）重复电针预处理对EAAT3-/-小鼠EAATs表达的影响： EAAT3-/-小鼠（28-32g），随机分为2组（n=5）：①Control组；②EA组：重复电针预处理（百会穴，1mA，2/15Hz，30min/d，5d），最后一次处理24h后，处死动物取脑，Western Blot定量检测EAAT1、EAAT2蛋白表达水平。结果:（1）与MCAO组相比，电针预处理可明显降低EAAT3-/-小鼠的NDS陷评分(P<0.05)，减小脑梗死容积(P<0.05)；（2）与Control组相比，电针预处理可增加EAAT2在皮层和海马的蛋白表达水平(P<0.05)。结论:重复电针预处理对EAAT3-/-小鼠局灶性脑I/R具有保护作用。提示电针预处理诱导脑保护不是通过EAAT3，因为采用EAAT3-/-小鼠不能逆转其保护作用。第二部分HMGB1在重复电针预处理诱导脊髓保护的作用及机制实验一重复电针预处理诱导大鼠脊髓保护的长时程效应及再灌注后HMGB1表达变化目的：观察重复电针预处理诱导大鼠脊髓保护的长时程效应及对再灌注后HMGB1表达影响。方法：（1）HMGB1对重复电针预处理诱导大鼠脊髓保护长时程效应的影响：雄性SD大鼠（300-350g），随机分为5组（n=8）：①Sham组：假手术组；②rHMGB1组：鞘内注射rHMGB1（200μg，1次/d，5d）；③I/R组：模型组；④EA组：重复电针预处理（足三里穴，1mA，2/15Hz，30min/d，5d），最后一次处理24h行脊髓缺血模型（缺血12min）；⑤EA+rHMGB1组：每次电针前30min，鞘内注射rHMGB1（200μg，1次/d，5d），重复电针预处理（足三里穴，1mA，2/15Hz，30min/d，5d），最后一次处理24h行脊髓缺血模型（缺血12min）。再灌注2、5、7、14天行神经功能学（Tarlov）评分。于再灌后2d和14d，取脊髓（L5-7）行组织病理学观察，计数剩余正常运动神经元和凋亡的神经元。（2）重复电针预处理对再灌注后HMGB1的表达影响：雄性SD大鼠（280-320g），随机分为3组（n=4）：①Sham组：假手术组；②I/R组：模型组；③电针处理组(EA+I/R)：重复电针预处理（足三里穴，1mA，2/15Hz，30min/d，5d），最后一次处理24h后行脊髓缺血模型（缺血12min）。再灌注2、5、7和14天时，取脊髓组织做RT-PCR和Weston Blot检测HMGB1的表达水平。结果：（1）重复电针预处理诱导大鼠脊髓保护的长时程效应：再灌注后2、5、7和14天，电针预处理可显著提高神经功能学评分。但其作用被rHMGB1所逆转（P<0.05，EA+rHMGB1vs rHMGB1）。再灌注2、14天后，电针组正常脊髓前角神经元数量显著多于同一时间点的I/R组(P <0.05，EA+I/R vs I/R)。电针组凋亡神经元计数显著减少（P <0.05，EA+I/R vs I/R）。该结果提示，电针预处理对大鼠脊髓I/R损伤具有长时程保护作用，r HMGB1可逆转电针的保护作用。（2）重复电针预处理对再灌注后HMGB1的表达影响：与Sham组相比，再灌注后2、5、7和14天， I/R组HMGB1的m RNA表达水平显著增高（P <0.05）。电针预处理可显著下调脊髓I/R后HMGB1的基因转录（P <0.05， EA+I/R vs I/R）。与Sham组相比，再灌注后2、5和7天， I/R组HMGB1的蛋白表达水平显著增高（P<0.05）。给予电针预处理可下调脊髓I/R后HMGB1的蛋白水平，尤其再灌注后5、14天具有显著统计学差异（P <0.05，EA+I/R vs I/R）。结论：重复电针预处理对大鼠脊髓I/R损伤具有长时程保护作用，其机制是通过降低HMGB1的转录和翻译。给予r HMGB1可逆转电针的保护作用。实验二HMGB1促进脊髓神经元细胞凋亡的机制目的：观察HMGB1介导脊髓神经元细胞凋亡的机制，是直接导致神经元凋亡，还是通过激活巨噬细胞分泌某种细胞因子介导神经元凋亡。方法：（1）HMGB1介导脊髓神经元细胞凋亡的机制：原代培养的脊髓神经元细胞，分成8组：①PBS+脊髓神经元；②HMGB1（10ng/mL）+脊髓神经元；③HMGB1（50ng/mL）+脊髓神经元；④HMGB1（100ng/mL）+脊髓神经元；⑤PBS+RAW264.7细胞：⑥HMGB1处理RAW264.7的条件培养基(10μl)+脊髓神经元；⑦HMGB1处理RAW264.7的条件培养基(50μl)+脊髓神经元；⑧HMGB1处理RAW264.7的条件培养基(100μl)+脊髓神经元，处理后1、3、5、7和9天，采用MTT检测细胞活性，处理后7天流式细胞仪检测神经元的凋亡。（2）ELISA筛选HMGB1处理RAW264.7细胞分泌的细胞因子：培养小鼠巨噬细胞（RAW264.7），分成2组：①对照组：PBS+RAW264.7细胞；②HMGB1处理组：HMGB1（100ng/mL）+RAW264.7细胞，采用ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8。（3）TNF-中和抗体对HMGB1处理后的培养基所致脊髓神经元凋亡和活性的影响：①对照组培养基+对照抗体；②对照组培养基+TNF-中和抗体；③HMGB1处理的条件培养基+对照抗体；④HMGB1处理的条件培养基+TNF-中和抗体，处理后1、3、5、7和9天，采用MTT检测细胞活性，处理后7天后流式细胞仪检测神经元的凋亡。结果：（1）HMGB1处理RAW264.7细胞通过分泌因子的方式促进脊髓神经元细胞凋亡：不同浓度的HMGB1（10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL）直接处理脊髓神经元细胞，未见明显神经元凋亡和细胞活性变化（P>0.05）。且PBS组和PBS处理RAW264.7组，也未见明显神经元凋亡和细胞活性变化（P>0.05）。而添加三种不同浓度(10μl、50μl、100μl)的HMGB1处理RAW264.7细胞条件培养基的神经元组，神经元凋亡率明显增多，分别为12.56%、26.52%、45.32%。神经元的活性有降低趋势，尤其是在处理后第9天神经元细胞活性显著降低（P <0.05）。（2）ELISA筛选HMGB1处理RAW264.7细胞分泌的细胞因子：与对照组相比，HMGB1处理后，可显著增加TNF-、IL-1β、IL-6、IL-8水平，其中TNF-表达水平增加最为显著（P <0.05）。（3）TNF-α中和抗体对HMGB1处理的条件培养基所致脊髓神经元凋亡和活性的影响：HMGB1处理的条件培养基可促进脊髓神经元细胞的凋亡（P <0.05），加入TNF-中和抗体后，神经元细胞的凋亡速度明显减慢（P<0.05），在处理后7、9天细胞活性得以恢复（P<0.05），该结果说明HMGB1处理RAW264.7通过分泌的细胞因子TNF-促进脊髓神经元细胞凋亡，给予TNF-中和抗体可中和培养基TNF-，而减轻脊髓神经元凋亡。结论: HMGB1通过激活RAW264.7细胞增加分泌TNF-而介导了脊髓神经元凋亡。小结1.重复电针预处理“百会穴”诱导大鼠脑保护，主要通过上调EAAT2在皮层的表达,具有脑区特异性。给予EAAT2抑制剂DHK，可逆转电针预处理诱导脑保护作用，说明EAAT2介导电针预处理诱导的脑保护。2.重复电针预处理对EAAT3-/-小鼠局灶性脑I/R具有保护作用。提示重复电针预处理诱导脑保护不是通过EAAT3，因为采用EAAT3-/-小鼠不能逆转其保护作用。3.重复电针预处理“足三里穴”对大鼠脊髓I/R损伤具有长时程保护作用，其主要机制是通过降低脊髓I/R后HMGB1的转录和翻译，给予重组HMGB1(rHMGB1)可逆转电针预处理诱导的脊髓保护。4. HMGB1介导脊髓神经元细胞凋亡的机制，是通过激活巨噬细胞促进分泌TNF-所致。离体实验给予TNF-中和抗体可中和培养基TNF-，而减轻HMGB1介导的脊髓神经元凋亡。