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肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。许多化疗药物已被用于肺癌患者的临床治疗。但随着肿瘤细胞对药物敏感性的降低,治疗效果却并不太理想。维生素D是一种脂溶性的维生素,为一组具有抗佝偻病作用,结构类似的固醇类衍生物总称。研究表明,维生素D缺乏与各种癌症密切相关,包括直肠癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）信号通路能够将胞外信号传递到细胞核中,它充分参与到细胞增殖分化、血管生成和代谢等生理活动中。我们推测维生素D可通过抑制肿瘤细胞的代谢重编程,抑制肿瘤细胞的干性维持,增加化疗药物的敏感性,其机制与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。本研究通过体内和体外实验,多层次研究1,25-（OH）2-Vit D3联合顺铂（CDDP）对肺癌的治疗效应及相关机制,从而为肺癌的治疗提供新的方向和选择。第一部分维生素D对非小细胞肺癌细胞生物学行为和裸鼠体内成瘤能力的影响及其机制研究目的:研究维生素D（1,25-（OH）2-Vit D3）对A549及NCI-H1975肿瘤细胞恶性行为的影响（增殖、凋亡、侵袭、转移以及耐药相关蛋白的影响）;检测PI3K/AKT/mTOR信号通路激活情况,同时评价维生素D对顺铂治疗效果的影响。方法:通过CCK-8实验检测不同浓度的1,25-（OH）2-Vit D3以及不同浓度的顺铂对细胞增殖能力的影响;利用流式细胞术检测不同处理条件下细胞凋亡比率的变化;用Western blot检测凋亡蛋白的表达变化;Transwell及划痕实验检测细胞的侵袭和转移能力;MTT实验检测药物敏感性;Western blot检测耐药相关蛋白pgp、ABCB2和ABCG2的表达变化。加入PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂后,用流式细胞术检测细胞凋亡变化;Transwell及划痕实验检测细胞侵袭和转移能力;Western blot检测凋亡相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路表达变化。将裸鼠分为四组:对照组,维生素D（1,25-（OH）2-Vit D3）处理组,顺铂处理组,维生素D（1,25-（OH）2-Vit D3）+顺铂联合处理组,进行裸鼠成瘤实验。每2天测量肿瘤的长径及短径,计算肿瘤体积变化,绘制肿瘤生长曲线。收集肿瘤组织进行病理切片观察病理变化;Western blot检测肿瘤组织耐药相关蛋白表达变化;同时检测肿瘤组织中PI3K/AKT/mTOR信号通路的蛋白表达变化。结果:1.A549和NCI-H1975肺癌细胞经过维生素D处理后,与对照组相比,存活率都下降。维生素D浓度越高,存活率下降越多;A549和NCI-H1975肺癌细胞经过维生素D和顺铂处理后,在保持维生素D的浓度不变的情况下,随着顺铂浓度的增加,细胞存活率呈现递减的趋势,且结果均有统计学意义,表明维生素D可以抑制细胞增殖。2.A549和NCI-H1975肺癌细胞分别分为四组:对照组,顺铂处理组,维生素D处理组和维生素D+顺铂联合处理组。与对照组相比,维生素D处理显著增加了细胞的凋亡比例,显著抑制了侵袭、转移能力以及增强了对化疗药物的敏感性,且结果均具有统计学差异,表明维生素D促进了NSCLC细胞凋亡,抑制NSCLC细胞的侵袭和转移能力并且上调化疗药物敏感性。3.PI3K抑制剂（LY294002）或AKT抑制剂（GSK690693）或mTOR抑制剂（AZD8055）处理后,与对照组和相对应的抑制剂组相比,维生素D处理组的细胞侵袭、转移能力有明显减弱;PI3K及PI3K磷酸化,AKT及AKT磷酸化和mTOR及mTOR磷酸化的蛋白表达水平有明显减少,细胞凋亡比率有明显增加,且具有统计学差异,表明维生素D对NSCLC细胞的影响与PI3K/AKT/mTOR信号通路有一定相关性。4.经过维生素D处理后,与对照组相比,体内动物实验小鼠的肿瘤体积变化,肿瘤炎症浸润范围,耐药相关蛋白和PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达均得到了明显的抑制,且具有统计学差异,表明维生素D在体内对NSCLC具有抑制作用。结论:维生素D能抑制非小细胞肺癌（NSCLC）细胞A549和NCI-H1975的增殖、侵袭和转移并促进细胞凋亡,并且上调化疗药物的敏感性。维生素D对NSCLC细胞A549和NCI-H1975的影响与PI3K/AKT/mTOR信号通路有一定相关性,并且维生素D对CDDP的治疗作用起到促进作用。第二部分维生素D通过PI3K/AKT/mTOR通路调控肿瘤细胞代谢重编程及干性维持目的:研究维生素D（1,25-（OH）2-Vit D3）对A549及NCI-H1975肿瘤细胞代谢重编程及细胞干性维持的影响,评价PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活情况。方法:加入1,25-（OH）2-Vit D3作用后,检测细胞中ATP产生、葡萄糖摄取及乳酸形成变化。Western blot检测代谢相关酶GLUT1、LDHA、HK2和PKM2的表达变化。葡萄糖抑制剂2-deoxy-D-glucose（2DG）和（或）1,25-（OH）2-Vit D3处理后,检测细胞中ATP产生、葡糖糖摄取及乳酸形成率变化;Western blot检测代谢相关酶GLUT1、LDHA、HK2和PKM2的表达变化。利用体外肿瘤球形成实验评价1,25-（OH）2-Vit D3对肿瘤形成的抑制作用。1,25-（OH）2-Vit D3处理后,用流式细胞术检测肿瘤干细胞占比变化（CD133+CD44+）;Western blot检测干性相关基因OCT4、SOX-2、Nanog表达变化。PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂和1,25-（OH）2-Vit D3处理后,评价糖摄取及乳酸形成;检测干性维持相关蛋白表达变化;Western blot检测代谢相关蛋白以及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达变化。将裸鼠分为三组:对照组、1,25-（OH）2-Vit D3处理组、2-deoxy-D-glucose（2DG）+1,25-（OH）2-Vit D3联合处理组,进行裸鼠成瘤实验。每2天测量肿瘤的长径及短径,计算肿瘤体积变化,绘制肿瘤生长曲线。收集肿瘤组织,检测干性相关基因OCT4、SOX-2、Nanog的表达变化;评价代谢相关酶GLUT1、LDHA、HK2和PKM2的表达变化。同时检测PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达情况。结果:1.与对照组相比,维生素D处理组、2DG组和维生素D+2DG组的葡萄糖摄取、ATP含量、乳酸水平以及代谢相关酶的相对表达量明显下降,且具有统计学差异,表明维生素D对NSCLC糖酵解有抑制作用。2.维生素D处理后,与对照组相比,肿瘤球形成面积减小,流式双阳性（CD44+/CD133+）比例减小,干性维持基因的蛋白相对表达量显著降低,且具有统计学差异,表明维生素D能抑制NSCLC肿瘤细胞干性维持和肿瘤形成。3.与对应抑制剂处理组相比,维生素D和抑制剂联合处理显著抑制了糖摄取、乳酸形成、干性维持基因的蛋白表达以及磷酸化PI3K（或AKT、mTOR）的蛋白表达水平,且具有统计学差异,表明维生素D可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活。4.体内动物实验中,小鼠的裸鼠肿瘤体积、干性相关蛋白相对表达量、代谢相关酶的表达以及磷酸化PI3K（或AKT、mTOR）的蛋白表达水平,与对照组相比,维生素D组都显著减小。与维生素D组比较,2DG+维生素D组的结果也成减小趋势,且均具有统计学差异,表明维生素D在动物体内抑制NSCLC的Warburg效应和PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活。结论:维生素D对糖酵解及糖酵解相关酶的表达具有抑制作用,可抑制肿瘤细胞代谢重编程的过程;维生素D能抑制肿瘤细胞干性的维持及肿瘤形成能力;维生素D可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活;维生素D联合2DG,增加了以上三个结论的抑制效果。