目的:蒽环类药物阿霉素(doxorubicin,DOX)是临床抗实体肿瘤及白血病应用最广泛的一线化疗药,但其引起的心脏毒副作用乃至心力衰竭严重限制了其临床应用。近期研究发现自噬(autophagy)在阿霉素诱导的心肌损伤(DOX-inducedmyocardial injury,DIMI)中发挥重要作用;同时大量的证据表明哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target ofrapamycin,mTOR)和转录因子EB(transfactor EB,TFEB)是自噬的关键调控因子。中药复方丹七片(由丹参和三七组成)在临床上被广泛用来治疗心血管系统疾病;丹参酮Ⅱ A(tanshinone Ⅱ A)来源于丹参根部,临床应用表明其具有广泛的心血管保护作用,同时也有研究报道了丹参酮ⅡA对DIMI的保护作用。本研究致力于丹七片及丹参酮ⅡA对DIMI的保护作用,并深入探讨其对自噬的内在调控机制。方法:1.复制尾静脉注射阿霉素小鼠模型并进行整体药效评价:小鼠行尾静脉注射阿霉素(浓度:10mg/mL;剂量:5mg/kg),每7天注射一次,连续注射4周。生理盐水组注射等剂量生理盐水。判定模型是否成功的评价指标包括:射血分数(Ejectionfraction,EF)和短轴缩短率(Fractional shortening,FS)显著降低;心肌组织出现细胞排列疏松紊乱、肌纤维横纹溶解、核固缩或破裂、心肌间质内出现炎细胞浸润等病理改变;心衰的生物标志物血清NT-proBNP、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isozymes,CKMB)和乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)的水平显著升高。综上方法复制稳定的阿霉素尾静脉注射诱导心肌损伤的小鼠模型。Specific pathogen free(SPF)级C57雄鼠60只,随机分为空白组、生理盐水组、阿霉素组、阿霉素+丹参酮ⅡA(10 mg/kg)组、阿霉素+普伐他汀(pravastatin,750 μg/kg)组、阿霉素+丹七片(1.5 g/kg/d;丹参:三七=1:1)组。药物以羧甲基纤维素钠(Sodiumcarboxymethyl cellulose,CMC-Na)水溶液方式每天灌胃,连续28天,空白组、生理盐水组和阿霉素组动物给予同体积CMC-Na水溶液。超声检测射血分数(Ejection fraction,EF)、短轴缩短率(Fractional shortening,FS)、左室收缩末内径(Left Ventricular End Systolic Diarneter,LVEDs)和左室舒张末内径(Left Ventricular End Diameter,LVED;d)等指标;苏木素-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色和Masson染色法检测心肌组织病理变化;记录每周体重情况;Elisa法检测血清CKMB和LDH的水平;Tunel法检测心肌细胞凋亡情况;免疫蛋白印记(Western blot,WB)法检测凋亡相关蛋白 B-cell lymphoma-2(Bcl-2)和 Bcl-2-associated X(Bax)。综上方法评价丹七片及丹参酮ⅡA减轻DIMI,保护心功能的作用。2.基于整体动物模型的丹七片及丹参酮ⅡA对自噬关键蛋白的调控作用研究:分组为空白组、生理盐水组、阿霉素组、阿霉素+丹参酮ⅡA组、阿霉素+普伐他汀组、阿霉素+丹七片组。电镜检测左心室心肌细胞内自噬体、自噬溶酶体数量;Elisa法检测溶酶体相关组织蛋白酶的活性;WB法检测自噬指示蛋白LC3和P62;自噬相关蛋白Beclin1;溶酶体相关蛋白LAMP1;自噬通路调控蛋白mTOR、4E-binding protein 1(4E-BP-1)、UNC-51样激酶1(ULK1)和TFEB的水平。综上方法评价丹七片及丹参酮ⅡA对DIMI自噬水平的调控。3.复制阿霉素诱导离体心肌细胞损伤模型并监测自噬流的改变:(1)分组为正常组、阿霉素0.1 μM组、阿霉素0.5μM 组、阿霉素1 μM组、阿霉素2μM组;以不高于2 μmol/L(DOX>2μmol/L无临床意义)的阿霉素诱导H9C2心肌细胞24小时;细胞计数试剂盒(Cell countingkit-8,CCK-8)检测细胞增殖率;WB法检测凋亡蛋白、自噬指示蛋白LC3、P62和Beclin1的水平。(2)分组为正常组、BafA1组、BafA1+阿霉素组、阿霉素组;联合自噬体-溶酶体融合抑制剂巴弗洛霉素(Bafilomycin A1,BafA1)预处理H9C2心肌细胞4小时;WB法检测LC3水平;以双荧光串联GFP-mRFP-LC3腺病毒为载体,瞬时转染H9C2细胞观察荧光表达,以监测和量化自噬体和自噬溶酶体的数量。综上方法构建阿霉素诱导离体H9C2心肌细胞损伤模型并检测阿霉素诱导对心肌细胞自噬流的影响。4.丹七片及丹参酮ⅡA对阿霉素诱导的心肌细胞损伤模型自噬流的影响及作用机制研究:分组为正常组、阿霉素组、阿霉素+丹参酮ⅡA组、阿霉素+丹七片组;CCK8法检测细胞增殖率;联合BafA1检测LC3和P62水平;GFP-mRFP-LC3双荧光标记心肌细胞监控自噬流变化;联合mTOR激动剂反向验证药理机制,监控自噬流的变化,检测Beclin1、LAMP1以及mTOR、ULK1、TFEB的水平,对心肌细胞进行慢病毒稳定转染标记TFEB,观察其胞浆胞核分布。5.构建肿瘤细胞模型验证药物对阿霉素抗肿瘤活性的影响:1 μM阿霉素联合丹七片及丹参酮ⅡA刺激肿瘤细胞,包括肝癌细胞(HepG2 cells)、乳腺癌细胞(MCF-7 cells)、人胶质母细胞瘤(U87 cells),于24小时、48小时和72小时检测细胞增殖率,观察药物在减轻阿霉素毒副作用的同时是否会降低其抗肿瘤活性。结果:1.丹七片及丹参酮ⅡA对尾静脉注射阿霉素小鼠模型的药效评价超声结果提示,与注射生理盐水组相比,阿霉素组EF%和FS%均下降,LVEDs和LVED;d均升高,阿霉素诱导小鼠心肌损伤模型构建成功;生理盐水组与空白组的各指标无统计学差异;与阿霉素组相比,丹七片及丹参酮ⅡA治疗显著增强心功能,改善左心室扩张。HE和Masson染色结果显示,与阿霉素组相比,丹七片及丹参酮ⅡA治疗能够改善心肌组织结构紊乱、肌纤维断裂溶解及心肌纤维化的情况。此外,丹七片及丹参酮ⅡA能够减轻阿霉素引起的体重降低和生长减缓的问题,减少血清中LDH和CKMB的释放。Tunel和WB结果提示,丹七片及丹参酮ⅡA能够调控凋亡相关蛋白,改善阿霉素引起的心肌细胞凋亡。2.丹七片及丹参酮ⅡA对尾静脉注射阿霉素小鼠模型自噬水平的调控电镜结果显示,丹七片及丹参酮Ⅱ A能显著改善阿霉素引起的自噬溶酶体累积现象。LC3、P62的WB结果进一步确认丹七片及丹参酮ⅡA能改善阿霉素引起的自噬水平失调。此外,丹七片及丹参酮ⅡA可以显著增强溶酶体相关组织蛋白酶B的活性。WB结果表明,丹七片及丹参酮ⅡA能上调自噬体形成过程的关键蛋白Beclin1和自噬溶酶体降解过程的关键蛋白LAMP1;在调控自噬的上游通路中,丹七片及丹参酮ⅡA能够抑制mTOR、4E-BP-1及ULK1的磷酸化水平,增加核内TFEB的表达量。3.阿霉素诱导离体H9C2心肌细胞损伤模型的构建和自噬流的评价CCK-8结果显示,阿霉素明显降低细胞增殖率且呈剂量依赖性,以1μmol/L阿霉素处理细胞24 h时,细胞活力显著下降。此外,与正常组相比,0.1-1 μmol/L阿霉素刺激引起Bax、Bcl-2分别呈剂量依赖性升高、降低,表明了阿霉素能够促进H9C2心肌细胞凋亡,在浓度1μmol/L时,其作用尤为显著。综上,确定1 μmol/L阿霉素诱导离体H9C2心肌细胞损伤模型构建成功。基于此模型,与正常组相比,阿霉素刺激使LC3Ⅱ和P62表达显著增加,而Beclin1减少。BafA1单独处理H9C2心肌细胞引起LC3ⅡI显著积累,当其联合阿霉素处理时,LC3Ⅱ的积累减少。进一步的GFP-mRFP-LC3荧光结果显示,与正常组相比,阿霉素处理后的细胞黄色斑点减少,红色斑点明显增加。综上结果表明阿霉素刺激导致自噬溶酶体累积,自噬体数量减少,最终自噬流受阻。4.丹七片及丹参酮ⅡA通过mTOR-ULK1/TFEB调控自噬的机制研究CCK-8结果显示,与阿霉素组相比,25～100 μg/mL的丹七片及1～20 μM的丹参酮ⅡA能显著提高细胞活力,最终确定丹七片及丹参酮ⅡA的浓度分别为25 μg/mL、1 μM。WB结果显示,与阿霉素组相比,丹七片及丹参酮ⅡA降低LC3Ⅱ、P62的水平;当联合应用BafA1时,丹七片及丹参酮ⅡA增加LC3Ⅱ的表达。此外,丹七片及丹参酮ⅡA可增加溶酶体相关组织蛋白酶B的活性。GFP-mRFP-LC3荧光结果表明,与阿霉素组相比,丹七片及丹参酮ⅡA减少自噬溶酶体的积累,增加自噬体的数量,最终恢复自噬流。此外,丹七片及丹参酮ⅡA能上调Beclin1和LAMP1,下调mTOR、S6K及ULK1的磷酸化水平,增加核内TFEB的表达量。加入mTOR激动剂MHY1485后,丹七片及丹参酮ⅡA对mTOR、S6K、TFEB、Beclin1、LAMP1等蛋白的调控作用减弱或消失,表明丹七片及丹参酮ⅡA通过抑制mTOR调控自噬不同阶段的关键蛋白。另外加入MHY1485削弱了丹七片及丹参酮ⅡA对自噬流的调控作用,进一步表明丹七片及丹参酮ⅡA通过抑制mTOR调控自噬关键蛋白,最终恢复自噬流。5.丹七片及丹参酮ⅡA对阿霉素抗肿瘤活性的影响CCK-8结果表明,与单独使用阿霉素相比,联合10;25;50 μg/mL的丹七片分别刺激HepG2细胞、MCF-7细胞、U87细胞24小时、48小时和72小时,对细胞增殖率无影响;与单独使用阿霉素相比,联合1;5;20 μM的丹参酮ⅡA分别刺激HepG2细胞、MCF-7细胞、U87细胞24小时、48小时、72小时,均能提高阿霉素的抗肿瘤效果。结论:1.药效研究提示丹七片及丹参酮ⅡA有效改善阿霉素引起的左心室扩张,提高心功能;改善阿霉素导致的心肌病理性结构损伤;减少心肌细胞凋亡。2.机制研究提示丹七片及丹参酮ⅡA通过调控mTOR相关信号通路调控自噬不同阶段而恢复自噬流,具体来讲,通过mTOR-TFEB通路促进自噬溶酶体的降解,并通过mTOR-ULK1通路促进自噬体的形成。3.丹七片及丹参酮ⅡA与阿霉素联合应用时,不影响其抗肿瘤活性。