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研究背景皮肤的创伤愈合是对损伤组织复杂、动态的修复过程,一般包括炎症反应期,细胞增殖期和重塑期三个相互重叠的时期。多种因素可以影响创面的修复,如血管神经病变、机体营养状态、感染、药物、免疫功能障碍等。糖尿病导致的难愈创面是临床常见的慢性创面之一。糖尿病慢性创面的形成是一个多因素共同作用的结果,其致病机制仍不完全明确。糖尿病状态下,体内蓄积的糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)可通过抑制调节细胞、修复细胞和细胞外基质的功能从而影响创面愈合的各个阶段,最终导致创面的难愈。尽管大量的研究聚焦于对糖尿病创面的治疗,然而糖尿病难愈创面形成的潜在机制仍不明确。自噬是细胞通过溶酶体系统对胞内积聚的蛋白质和受损细胞器进行降解,然后再利用的代谢途径,是细胞维持自身稳态和存活的机制之一。临床研究已证实免疫抑制剂雷帕霉素治疗移植后抗排斥反应时,能够导致患者创面的愈合延迟,同时雷帕霉素被认为是经典的自噬诱导剂,这表明自噬可能与创面的愈合过程相关。本研究拟通过建立小鼠背部皮肤创面模型探讨自噬在糖尿病慢性创面形成中的作用,并进一步通过体外实验阐明AGEs诱导的自噬导致创面愈合延迟的机制。目的阐明自噬对糖尿病创面愈合的影响和作用,并探讨其可能的分子机制。方法第一部分:构建C57BL/6小鼠全层皮肤缺损模型,采用免疫组化和免疫荧光技术检测创面愈合过程各时相点(d0,d1,d3,d7,d14,d21)LC3和Beclin-1的表达,观察自噬在创面愈合中的变化。同时,应用电镜观察创面自噬体的数量和结构;通过小鼠腹腔注射雷帕霉素和3-MA,观察自噬增强或抑制后对创面愈合的影响;建立db/db糖尿病小鼠及db/m对照组小鼠全层皮肤创面模型,应用3-MA干预db/db糖尿病小鼠,观察各组小鼠创面愈合时间,并通过免疫组化和免疫荧光技术检测LC3在各组小鼠创面中的表达差异。同时,收集临床糖尿病和非糖尿病患者的正常组织(各5例)及慢性创面组织(糖尿病患者44例,非糖尿病患者20例),通过免疫组化技术检测创面LC3的表达。第二部分:构建C57BL/6小鼠全层皮肤缺损模型,经皮肤创缘注射AGEs,观察创面愈合时间,应用免疫组化方法检测创面愈合过程中(d0,d3,d7,d14)LC3的表达。另外,在AGEs创缘注射的同时腹腔注射3-MA,观察创面的愈合情况,并应用免疫荧光和激光共聚焦观察LC3的细胞定位。分别用雷帕霉素和3-MA处理RAW264.7细胞,通过western blot技术观察巨噬细胞LC3的改变,流式细胞学技术检测巨噬细胞膜标记物CD11c(M1)和CD206(M2)的表达,并利用real-time PCR技术检测巨噬细胞M1或M2相关细胞因子的表达。应用AGEs或者AGEs和3-MA同时干预RAW264.7细胞,通过电镜观察细胞自噬体变化,应用western blot技术观察巨噬细胞LC3的改变,利用流式细胞学和real-time PCR技术检测巨噬细胞的极化。第三部分:构建shIRF8干扰的RAW264.7细胞株,AGEs干预RAW264.7以及shIRF8细胞株,通过应用western blot、免疫荧光和激光共聚焦观察巨噬细胞LC3的改变,并通过real-time PCR技术检测巨噬细胞极化的改变。结果第一部分:LC3和Beclin1在小鼠皮肤创面中均有表达,且创伤后表达均逐渐增多,d7、d14表达最高,以后逐渐减少,d21基本恢复正常;雷帕霉素能够明显增加LC3的表达,而3-MA抑制LC3的表达。电镜观察自噬小体的数量在d7明显增加。雷帕霉素组小鼠创面愈合明显延迟,同时应用3-MA干预小鼠后,创面愈合加快;db/db小鼠较对照组db/m小鼠创面愈合时间明显延迟(25.8?0.59vs 15.9?0.82 d),经腹腔注射3-MA后创面愈合速度加快,但仍迟于db/m组小鼠。db/db组小鼠创面LC3表达在各时间点均高于对照组小鼠;糖尿病患者慢性创面组织中LC3的表达明显高于非糖尿病创面组织。第二部分:AGEs组小鼠较对照组创面愈合时间明显延迟(18.0?0.67 vs14.8?0.79 d),3-MA与AGEs同时干预组小鼠愈合时间较AGEs组加快(15.0?0.82d),但仍迟于对照组小鼠。AGEs组小鼠创面LC3表达在各时间点均高于对照组小鼠,d7、d14明显增高。通过免疫荧光和激光共聚焦技术证实大部分LC3的表达与F4/80发生共定位染色。细胞实验结果证实AGEs能够增强RAW264.7细胞LC3的表达,同时电镜结果显示自噬体增多。雷帕霉素能够增强巨噬细胞LC3的表达,并增加M1巨噬细胞标记物CD11c的阳性细胞数(27.86±1.37%vs 13.61±10.97%),而3-MA能够抑制LC3的表达,并且分别减少CD11c阳性细胞数。并且;雷帕霉素和3-MA分别能够增加和减少tnf-a、il-1b、il-6、inos的表达(M1相关细胞因子),而对M2相关的细胞因子的影响不明显。AGEs可以增加CD11c阳性的巨噬细胞数量(28.11±0.87%),并促进tnf-a、il-1b、il-6、inos等细胞因子,而3-MA能够抑制AGEs的作用。第三部分:RAW264.7巨噬细胞经shIRF8干扰后,AGEs对LC3的诱导受到抑制,并且shIRF8阻断了AGEs对tnf-a、il-1b、il-6、inos等M1相关炎症因子的的促进作用。结论1.糖尿病小鼠和糖尿病患者皮肤创面自噬增强与创面的愈合延迟相关;2.AGEs通过诱导巨噬细胞自噬促进M1的极化,从而影响创面的愈合;3.AGEs通过上调巨噬细胞IRF8的表达诱导自噬和促进M1的极化。