【摘 要】
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芳香族化合物是一类含有芳香性苯环或者杂环的有机物。由于某些芳香族化合物的化学合成工艺会使环境遭受严重的污染和威胁着人类的生命安全,代谢工程改造微生物合成芳香族化合物是一种很有前途的替代方法。研究表明微生物普遍存在的莽草酸途径为一些芳香族化合物的生物合成提供前体,因此本文利用大肠杆菌中的莽草酸途径设计并构建了生产苯酚,酪醇和羟基酪醇三种芳香族化合物的非天然代谢的生物合成途径。本文的主要研究成果如下:
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芳香族化合物是一类含有芳香性苯环或者杂环的有机物。由于某些芳香族化合物的化学合成工艺会使环境遭受严重的污染和威胁着人类的生命安全,代谢工程改造微生物合成芳香族化合物是一种很有前途的替代方法。研究表明微生物普遍存在的莽草酸途径为一些芳香族化合物的生物合成提供前体,因此本文利用大肠杆菌中的莽草酸途径设计并构建了生产苯酚,酪醇和羟基酪醇三种芳香族化合物的非天然代谢的生物合成途径。本文的主要研究成果如下:1.构建了重组质粒 pRSFDuet-Ubic-bsdB-bsdC-bsdD,其中来自大肠杆菌K12的基因Ubic表达分支酸丙酮酸裂解酶,来自枯草芽孢杆菌168的三个基因bsdB,bsdC和bsdD表达对羟基苯甲酸脱羧酶。以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌成功的实现了苯酚的从头合成,其产量为14.3 mg/L。最后以三丁酸甘油酯为萃取剂,进行双相发酵使苯酚产量提高了 45.2%,达到了 26.1 mg/L。2.构建了重组质粒pETDuet-ARO10,来自酿酒酵母S288C的基因ARO10表达对羟基苯丙酮酸脱羧酶。以大肠杆菌JM109(DE3)为宿主菌成功实现了酪醇的从头合成其产量为46.7 mg/L。3.构建了重组质粒pETDuet-ARO10-hpaB-hpaC,来自铜绿假单胞菌PA01的基因hpaB和hpaC表达4-羟基苯乙酸-3-羟化酶。以大肠杆菌JM109(DE3)为宿主菌以及生产酪醇的基础上,实现了羟基酪醇的从头合成其产量为4.9 mg/L。4.在大肠杆菌JM109(DE3)中使用λ-red重组系统敲除了基因FeaB,阻断了副产物的生成,使酪醇和羟基酪醇的产量提高了 29.5%和56.2%,达到了 66.3 mg/L和11.2 mg/L。并在体外补充1 mM酪氨酸后,它们的产量进一步提高了 73.0%和39.5%,达到了 245.7 mg/L和 18.5 mg/L。
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