食管癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,发生以鳞癌为主。由于侵袭转移是大部分食管鳞癌患者死亡的主要原因,所以探讨食管鳞癌的侵袭转移机制对于食管鳞癌的治疗及预后至关重要。上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT),是指上皮细胞在些生理或病理因素的影响下失去细胞的顶面-底面极性和细胞间的连接作用,发生细胞骨架重组,促使有极性的上皮细胞转变成具有侵袭和迁移能力的成纤维样细胞的过程。EMT主要有以下几个特征：下调上皮性标志物,如,E-cadherin、细胞角蛋白(cytokeratin, CK)等；上调某些间质性标志物的表达,如,Vimentin、αα-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, a-SMA)、Fibronectin等；细胞形态发生明显的变化,由鹅卵石样的形态演变为纺锤形的纤维细胞态,使细胞获得了游走和迁移能力,具有了间质细胞的形态和特性,所以更有利于细胞穿过细胞外基质。EMT是胚胎发育的关键一步,同时也是肿瘤侵袭转移的一个重要机制。信号转导子和转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3, Stat3)是一种存在于胞浆的、与酪氨酸磷酸化信号通道相偶联的蛋白,是1994年在肝细胞中作为IL-6信号传递中的急性期反应因子(acute-phase response factor, APRF)被纯化的Stats家族中的重要一员,能够被多种细胞因子、生长因子和癌蛋白激活。一些研究显示Stat3是EMT发生过程中重要的转录因子,但有关Stat3调控EMT的机制尚不清楚。有研究表明,作为转录调控因子的Stat3可能通过对下游众多基因如Snail,Twist的调控在EMT中发挥重要作用。但Stat3是否通过调节Snail的表达在食管鳞癌EMT中发挥作用,目前对此尚无报道。本实验组已证明Stat3与食管鳞癌EMT的发生有关。为进一步证实Stat3是否通过调节Snail引发EMT,本实验主要进行了以下研究。1)采用免疫组化技术检测食管鳞癌组织中Snail蛋白的表达,分析Snail和活化的Stat3蛋白分别与E-cadherin、Vimentin蛋白表达的相关性；2)转染Stat3并用IL-6刺激,观察食管鳞癌细胞株EC-1中活化的Stat3、Snail、E-cadherin、Vimentin mRNA与蛋白表达的变化；3)将Snail siRNA转染稳定高表达Stat3的食管鳞癌细胞株EC-1,观察Snail、E-cadherin、Vimentin mRNA与蛋白表达的变化；4)采用Boyden chamber体外侵袭实验和划痕实验检测稳定高表达Stat3的食管鳞癌细胞株EC-1转染Snail siRNA后细胞体外侵袭能力及运动能力的变化。材料和方法1.采用免疫组织化学技术检测80例手术切除的食管鳞癌组织及其癌旁正常粘膜中Snail蛋白的表达情况。2.采用RT-PCR、Western-blot法检测转染pXJ40-Stat3-Flag并用IL-6刺激后的食管鳞癌细胞株EC-1中活化的Stat3、Snail、E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白表达的变化。3.采用RNA干扰技术将设计合成的Snail siRNA转染到稳定高表达Stat3的EC-1中,特异性沉默细胞中Snail基因的表达。4.采用RT-PCR、Western-blot法检测稳定高表达Stat3的EC-1转染Snail siRNA后0h、24h、48h、72h细胞中Snail E-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表达的变化。5.采用Boyden chamber体外侵袭实验检测稳定高表达Stat3的EC-1转染Snail siRNA后0h、24h、48h、72h细胞体外侵袭能力的变化。6.采用细胞划痕实验检测稳定高表达Stat3的EC-1转染Snail siRNA后24h、48h、72h细胞体外运动能力的变化。7.统计学处理所有数据均经SPSS17.0软件分析,计量资料采用X±S,均数间比较采用t检验和方差分析；计数资料采用阳性率,阳性率间比较采用x2检验,阳性率间相关性比较采用Pearson’s相关分析。以αα=0.05为差异有显著性。结果1.食管鳞癌组织中Snail蛋白的阳性表达率(73.8%)明显高于正常食管黏膜(30.0%)(P<0.01)。Snail蛋白表达与浸润深度有关,深层浸润组Snail蛋白阳性表达率明显(79.7%)高于浅层浸润组的阳性表达率(50.0%)(P<0.05)；Snail蛋白表达与病理分级有关,Ⅲ级(95.2%)阳性表达率明显高于Ⅰ级(47.4%)阳性表达率(P<0.01); Snail蛋白表达与性别(P>0.05)、年龄(P>0.05)和淋巴结转移无关(P>0.05)。2.食管鳞癌组织中Snail与E-cadherin表达呈负相关(r=-0.301,P<0.05),与Vimentin表达呈正相关(r=0.241,P<0.05)；活化的Stat3与E-cadherin表达呈负相关(r=-0.506,P<0.05),与Vimentin表达呈正相关(r=0.321,P<0.05); Snail表达与活化的Stat3表达呈正相关(r=0.396,P<0.01)。3. pXJ40-Stat3-Flag转染EC-1并用IL-6刺激,RT-PCR和Western-blot结果显示,转染PXJ40-Stat3-Flag并IL-6刺激组细胞中活化的Stat3和Snail mRNA和蛋白表达分别为Stat3:0.72±0.01 vs 0.72±0.03; Snail:0.60±0.02 vs 0.78±0.03o与IL-6刺激组(Stat3:0.57±0.02 vs 0.65±0.01; Snail:0.50±0.04 vs 0.70±0.02)、Stat3转染组(Stat3:0.65±0.01 vs 0.54±0.01; Snail:0.36±0.02 vs 0.60±0.05)、空载体组(Stat3:0.59±0.03 vs 0.52±0.04; Snail:0.36±0.03 vs 0.58±0.04）、空白组(Stat3:0.57±0.04 vs 0.53±0.05; Snail:0.38±0.02 vs 0.57±0.02)相比明显升高(P<0.01); Stat3 mRNA在Stat3转染组中的表达高于IL-6刺激组、空载体组和空白组(P<0.05); Stat3 mRNA在IL-6刺激组、空载体组和空白组中表达无显著性差异(P>0.05)；活化的Stat3蛋白在IL-6刺激组细胞中表达高于Stat3转染组、空载体组和空白组(P<0.05); Snail mRNA和蛋白在IL-6刺激组细胞中表达高于Stat3转染组、空载体组和空白组(P<0.05)。4.EC-1转染pXJ40-Stat3-Flag并用IL-6刺激,RT-PCR和Western-blot结果显示,转染pXJ40-Stat3-Flag并IL-6刺激组细胞中E-cadherin mRNA和蛋白为036±0.03和0.43±0.02,明显低于IL-6刺激组(0.42±0.03 vs 0.51±0.02)、Stat3转染组(0.53±0.02 vs 0.544-0.04)、空载体组(0.52±0.02 vs 0.54±0.03)和空白组(0.51±0.04 vs 0.53±0.02)(P<0.01)中的表达；E-cadherin mRNA和蛋白在IL-6刺激组细胞中表达低于Stat3转染组、空载体组和空白组(P<0.05)；E-cadherin mRNA和蛋白在Stat3转染组、空载体组与空白组中表达无显著性差异(P>0.05)。5.EC-1转染pXJ40-Stat3-Flag并用IL-6活化后,RT-PCR和Western-blot结果显示,转染pXJ40-Stat3-Flag并IL-6刺激组细胞中Vimentin mRNA和蛋白为074±0.02和0.74±0.04,明显高于IL-6刺激组(0.63±0.04 vs 0.60±0.01)、Stat3转染组(0.54±0.03 vs 0.52±0.02)、空载体组(0.56±0.02 vs 0.49±0.04)和空白组(0.56±0.01 vs 0.50±0.03)(P<0.01)中的表达；Vimentin mRNA和蛋白在IL-6刺激组细胞中表达高于Stat3转染组、空载体组和空白组(P<0.05); Vimentin mRNA和蛋白在Stat3转染组、空载体组与空白组中表达无显著性差异(P>0.05)。6.稳定高表达Stat3的EC-1转染Snail siRNA后,RT-PCR结果显示,转染24h、48h、72h后,干扰组Snail mRNA表达量均显著低于阴性对照组、空载体组和空白组,并且随着转染时间的延长表达量逐渐降低(24h 0.64±0.03 vs0.67±0.05、0.67±0.05、0.69±0.02,48h 0.53±0.03vs 0.69±0.03、0.68±0.03、0.70±0.03,72h 0.43±0.04 vs 0.68±0.06、0.65±0.04、0.68±0.03)(P<0.05)；转染24h、48 h、72h后,干扰组E-cadherin mRNA的表达量与各对照组相比明显升高,并且随着转染时间的延长表达量逐渐升高(24h 0.46±0.03 vs 0.39±0.06、0.39±0.04、0.40±0.04,48h 0.53±0.04 vs 0.40±0.03、0.38±0.03、0.39±0.0372h 0.62±0.02 vs 0.36±0.02、0.35±0.03、0.38±0.03)(P<0.05)；转染24h、48h、72h后,干扰组Vimentin mRNA的表达量与各对照组相比明显降低(P<0.05),其中转染后48h和72h Vimentin mRNA表达量明显低于24h(24h 0.69±0.04 vs0.77±0.05、0.78±0.07、0.80±0.06,48h 0.60±0.05 vs 0.79±0.03、0.79±0.040.77±0.03,72h 0.60±0.06 vs 0.78±0.05、0.76±0.03、0.79±0.05)(P<0.05),但转染后72 h与48 h相比无统计学差异(P>0.05)。7.稳定高表达Stat3的EC-1转染Snail siRNA后,Western-blot结果显示,转染24h、48h、72h后,干扰组Snail蛋白表达量均显著低于各个对照组,并且随着转染时间的延长表达量逐渐降低(24h 0.68±0.03 vs 0.73±0.03、0.73±0.020.72±0.04,48h 0.61±0.03 vs 0.72±0.02、0.74±0.03、0.70±0.01,72h 0.53±0.02 vs0.71±0.02、0.69±0.03、0.70±0.02)(P<0.05)。转染24h、48h、72h后,干扰组E-cadherin的蛋白表达量均显著高于各对照组,并且72h E-cadherin蛋白的表达量最高(24h 0.61±0.02 vs 0.51±0.08、0.51±0.05、0.50±0.04,48h 0.63±0.04 vs0.48±0.04、0.54±0.03、0.48±0.02,72h 0.74±0.02 vs 0.52±0.04、0.53±0.03、0.54±0.04)(P<0.05)。转染24h、48h、72h后,干扰组Vimentin的蛋白表达量均显著低于各对照组,并且随着转染时间的延长表达量逐渐降低(24h 0.59±0.02vs 0.62±0.02、0.64±0.02、0.63±0.03,48h 0.52±0.02 vs 0.64±0.02、0.63±0.02、0.62±0.02,72h 0.43±0.02 vs 0.63±0.01、0.64±0.04、0.60±0.02)(P<0.05)。8.稳定高表达Stat3的EC-1转染Snail siRNA后,Boyden chamber体外侵袭实验结果显示,转染24h、48h、72h后,干扰组与各个对照组相比,穿越Matrigel胶的细胞数均明显减少,并且随着转染时问的延长穿越的细胞数逐渐减少(Oh107.33±7.37 vs 107.67±5.51、111.67±11.02、108.50±9.16，24h 92.67±5.46vs110.66±11.37、113.23±1.15、110.33±3.06，48h 68.33±5.69 vs114.00±3.61、111.34±4.93、107.00±16.82，72h 53.67±7.77 vs112.66±3.51、107.06±1.53、104.33±7.09)(P<0.05)。9.稳定高表达Stat3的EC-1转染Snail siRNA后,细胞划痕实验结果显示,转染48h和72h后,干扰组与各个对照组相比,迁移的距离明显缩短(48h0.22±0.01vs0.31±0.02、0.29±0.03、0.30±0.01,72h 0.24±0.01 vs0.42±0.03、0.40±0.04、0.41±0.05)(P<0.05)。结论1.食管鳞癌组织中Snail蛋白表达明显上调,并与食管鳞癌的发生及高侵袭力相关；Snail与E-cadherin的表达呈负相关,与Vimentin的表达呈正正相关。Snail可能参与了食管鳞癌的EMT过程。2.转染并激活Stat3可以上调Snail的表达,并导致E-cadherin表达下调、Vimentin表达上调；Snail siRNA能够成功的沉默食管鳞癌细胞Snail的表达,并且上调E-cadherin表达,下调Vimentin表达。Snail诱导的EMT可能与Stat3信号蛋白有关。Stat3可能通过调节Snail的表达而参与食管鳞癌EMT的过程。3. Snail siRNA能够抑制Snail的表达,并降低食管鳞癌细胞体外侵袭能力,细胞运动也受到抑制,提示Snail siRNA能够有效抑制食管癌的恶性进展,Snail可望作为辅助治疗靶点在食管鳞癌治疗中发挥作用。