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第一部分大鼠蛛网膜下腔出血后脑组织中NOX2/NOX4的表达变化目的探讨大鼠蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)后还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH oxidase)家族中NOX2/NOX4的表达变化及其与早期脑损伤(Early brain injury,EBI)的相关性。方法1、实验动物分组:健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,被随机分为假手术组、SAH 3h组、SAH 12h组、SAH 2h组、SAH 48h组一共5组,每组12只大鼠。2、SAH组模型建立:抽取大鼠自体动脉血,注入视交叉前池。按照实验分组在3小时、12小时、24小时、48小时后处死大鼠并灌注取脑。3、应用蛋白印迹(Western-blot)法检测大鼠脑组织中NOX2/NOX4蛋白水平在SAH后不同时相的变化。免疫荧光共染分析大鼠SAH后神经元和星形胶质细胞中NOX2/NOX4的水平,以及NOX2/NOX4表达水平与脑细胞凋亡的关系。4、体外SAH模型建立:利用氧合血红蛋白(Oxy Hb)处理原代大鼠大脑皮层神经元细胞建立SAH体外模型。在体外神经元细胞培养基中添加Oxy Hb处理24小时后通过蛋白印迹(Western-blot)及免疫荧光染色观察Oxy Hb处理对神经元中NOX2/NOX4表达的影响。结果1、与假手术组相比,SAH后3小时NOX2/NOX4在脑组织中的表达开始增高,并且在SAH后12小时表达达到高峰(P<0.01),随后开始下降,但在SAH后48小时,NOX2/NOX4的蛋白表达水平仍明显高于假手术组(P<0.01)。2、SAH后12小时NOX2/NOX4在颞底脑组织神经元和星形胶质细胞中的表达较假手术组明显上升。在NOX2/NOX4高表达的脑细胞中呈现TUNEL阳性,NOX2/NOX4低表达的脑细胞中呈现TUNEL阴性。3、在体外神经元细胞培养基中添加Oxy Hb处理24小时后,NOX2和NOX4蛋白表达量显著上调(P<0.01),与大鼠体内SAH模型的结果相一致。结论NOX2/NOX4在SAH后12~24小时达到高峰,属于EBI时间段内(72小时内);在SAH后,血肿周围脑组织中,尤其是神经元和星形胶质细胞中NOX2/NOX4蛋白水平显著上升;NOX2/NOX4高表达伴随脑细胞凋亡,提示NOX2/NOX4可能参与到SAH后EBI的发生发展中。第二部分下调NOX2/NOX4对大鼠SAH后EBI的影响目的探讨下调NOX2/NOX4对大鼠SAH后EBI的影响,以及是否可以通过调控NOX2/NOX4缓解SAH后EBI。方法1.实验动物分组:健康成年雄性SD大鼠60只,被随机分为假手术组、SAH组、SAH+NOX2抑制剂gp91 ds-tat Peptide2组、SAH+NOX4抑制剂GKT137831组、SAH+NOX2&4抑制剂apocynin组,每组12只。2.给药方法:在SAH+gp91 ds-tat Peptide2组中,NOX2抑制剂gp91 ds-tat Peptide2溶于生理盐水,以100ng/kg每只大鼠的剂量进行侧脑室注射;在SAH+GKT137831组中,NOX4抑制剂GKT137831溶于生理盐水,以60 mg/kg体重的剂量进行皮下注射;在SAH+apocynin组中,NOX2&4抑制剂apocynin溶于生理盐水,以50 mg/kg体重的剂量进行腹腔注射。所有药物均在SAH造模前30分钟进行。vehicle组在SAH造模前30分钟同时在侧脑室、皮下及腹腔注射与干预组等量的生理盐水。3.SAH组模型建立:抽取大鼠自体股动脉血,颅骨钻孔后通过立体定向仪将非肝素化的动脉血注入视交叉前池。假手术组大鼠,同样行颅骨钻孔及股动脉穿刺抽血,但并未将动脉血注入视交叉前池。4.各组大鼠在建模24小时后通过行为学评分表评估其行为能力,然后处死大鼠,留取大鼠颞底皮层脑组织做标本。采用FLUORO-JADE B荧光染色法分析不同组SAH后神经元细胞退化情况;Western-blot法检测脑组织中白蛋白的含量,分析血脑屏障的完整性;运用TUNEL染色分析大鼠大脑皮层脑细胞的凋亡情况;采用干湿法测定及分析SAH后脑水肿情况。5.体外SAH模型:利用氧合血红蛋白(Oxy Hb)处理原代大鼠大脑皮层神经元细胞建立SAH体外模型。分为正常对照组、Oxy Hb组、Oxy Hb+NC组、Oxy Hb+si NOX2组、Oxy Hb+si NOX4组和Oxy Hb+si NOX2&4组,每个实验均进行三次独立重复。Oxy Hb组:在体外神经元细胞培养基中添加Oxy Hb处理24小时。Oxy Hb+NC组:Control Si RNA处理。si NOX2组、si NOX4组和si NOX2&4组:这三组体外培养的神经元分别瞬时转染si NOX2、si NOX4和si NOX2&4,然后接受Oxy Hb处理24小时进行检测。监测指标:采用Western Blot检测NOX2和NOX4的干预效果。通过MTT实验检测神经元的存活率,采用TUNEL荧光染色检测神经元细胞凋亡情况。通过检测细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量的变化来分析不同组别神经元的坏死情况。结果1.体内实验中大鼠SAH后24小时,FLUORO-JADE B荧光染色结果显示,与假手术组相比,三种NOX2/4抑制剂不同程度地抑制了神经元细胞退化,其中,apocynin效果最为显著。2.体内实验中TUNEL检测结果显示假手术组大脑皮层偶见TUNEL阳性细胞,SAH组散在较多的TUNEL阳性细胞。三种NOX2/4抑制剂预处理后TUNEL阳性细胞数发生了不同程度的降低,其中apocynin效果最显著。3.SAH后大鼠的脑水含量及脑组织白蛋白含量显著增加(P<0.01),三种NOX2/4抑制剂预处理后,脑水肿及脑组织白蛋白含量有所减轻,其中apocynin效果最显著。4.较SAH组相比,体内实验中三种NOX2/4抑制剂预处理后大鼠的神经行为学能力显著改善,其中apocynin效果最显著。5.体外实验中Western Blot检测结果显示在体外神经元细胞培养基中添加Oxy Hb处理24小时后,NOX2和NOX4蛋白表达量显著上调(P<0.01),与第一部分结果相一致;小干扰RNA处理可显著下调NOX2和NOX4的蛋白水平(P<0.01)。6.体外实验中通过小干扰RNA沉默NOX2/4后,神经元细胞的存活率较Oxy Hb+NC组明显上升(P<0.05)。7.体外实验中通过小干扰RNA沉默NOX2/4后,神经元细胞中TUNEL阳性细胞数量较Oxy Hb+NC组明显下降(P<0.01)。8.体外实验中通过小干扰RNA沉默NOX2/4后,神经元细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量较Oxy Hb+NC组明显下降(P<0.01)。结论在体内外SAH模型中,通过使用NOX2/NOX4抑制剂和小干扰RNA,可以减轻神经元凋亡和退化,以及脑水肿和血脑屏障损害;NOX2/NOX4参与SAH后神经元细胞的凋亡及退化,以及脑水肿及血脑屏障破坏的过程中。第三部分NOX2/NOX4参与SAH后EBI的作用机制研究目的探讨SAH后NOX2/NOX4通过何种机制参与SAH后EBI的调控。方法1.实验动物分组:60只健康成年雄性SD大鼠随机分为5组,分别为假手术组,SAH组,SAH+NOX2抑制剂gp91 ds-tat Peptide2组,SAH+NOX4抑制剂GKT137831组,SAH+NOX2&4抑制剂apocynin组,每组12只大鼠。2.给药方法:在SAH+gp91 ds-tat Peptide2组中,NOX2抑制剂gp91 ds-tat Peptide2溶于生理盐水,以100ng/kg每只大鼠的剂量进行侧脑室注射;在SAH+GKT137831组中,NOX4抑制剂GKT137831溶于生理盐水,以60 mg/kg体重的剂量进行皮下注射;在SAH+apocynin组中,NOX2&4抑制剂apocynin溶于生理盐水,以50 mg/kg体重的剂量进行腹腔注射。所有药物均在SAH造模前30分钟进行。vehicle组在SAH造模前30分钟同时在侧脑室、皮下及腹腔注射与干预组等量的生理盐水。3.SAH组模型建立:抽取大鼠自体股动脉血,颅骨钻孔后通过立体定向仪将非肝素化的动脉血注入视交叉前池。假手术组大鼠,同样行颅骨钻孔及股动脉穿刺抽血,但并未将动脉血注入视交叉前池。4.检测指标:SAH动物造模24小时后然后处死大鼠,取出大鼠颞底皮层脑组织做标本。采用ROS试剂盒测得血肿周围脑组织的ROS含量;采用蛋白质印迹(Western-blot)法分析脑组织中内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的标志蛋白CHOP和内质网应激介导的凋亡标志蛋白active-caspase-12的表达情况。5.体外SAH模型:利用氧合血红蛋白(Oxy Hb)处理原代大鼠大脑皮层神经元细胞建立SAH体外模型。分为正常对照组、Oxy Hb组、Oxy Hb+NC组、Oxy Hb+si NOX2组、Oxy Hb+si NOX4组和Oxy Hb+si NOX2&4组,每个实验均进行三次独立重复。Oxy Hb组:在体外神经元细胞培养基中添加Oxy Hb处理24小时。Oxy Hb+NC组:Control Si RNA处理。si NOX2组、si NOX4组和si NOX2&4组:这三组体外培养的神经元分别瞬时转染si NOX2、si NOX4和si NOX2&4,然后接受Oxy Hb处理24小时进行检测。监测指标:(Western-blot)法分析脑组织中CHOP和active-caspase-12的表达情况。结果1.在体内:三种NOX2/4抑制剂能不同程度的降低大鼠SAH后脑组织中的ROS含量,其中apocynin效果最显著。2.抑制NOX2/NOX4后大鼠SAH后血肿周围脑组织CHOP和active-caspase-12蛋白水平明显下降。3.在体外:si RNA干扰NOX2/NOX4可以降低氧合血红蛋白处理后神经元CHOP和active-caspase-12的蛋白水平(P<0.05)。结论SAH后血肿周围脑组织中ROS产生增多,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的标志蛋白CHOP和内质网应激介导的凋亡标志蛋白active-caspase-12表达上调,即SAH后内质网应激被激活,其介导的凋亡发生;抑制NOX2和NOX4的作用可以有效地缓解SAH引起的一系列损伤反应;NOX2和NOX4可能通过促进ROS产生,诱导内质网应激,介导其相关性凋亡的发生,加剧了EBI。