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展青霉素(Patulin,PAT)是由扩展青霉(Penicillium expansum)等产毒菌产生的,对细菌、植物和动物均具有较强毒性的聚酮类次级代谢产物。P.expansum侵染贮藏保鲜、加工和货架期的水果及其制品造成腐败,并在侵染过程中大量产生PAT。由P.expansum引起的青霉病在世界各国普遍存在,对全球水果产业造成了巨大的经济损失,而且由其产生的PAT严重威胁消费者的健康。随着生物防治水果采后病害研究的进展,利用拮抗酵母控制并降解水果及其制品中的PAT已经成为学术界研究的热点,并显示出巨大的应用前景。课题组筛选到一株卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica),前期研究发现P.caribbica可显著抑制苹果上PAT的积累。此外,P.caribbica还能在体外降解PAT。但是,P.caribbica降解PAT的产物、产物毒性、以及P.caribbica降解PAT的分子机制仍然未知。因此,本论文主要研究P.caribbica降解PAT的产物鉴定,降解产物的毒性分析,P.caribbica在基因表达水平(转录组学)和蛋白表达水平(基于iTRAQ(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification)的蛋白组学技术)对PAT的应答调控机制;PcCRG1基因在P.caribbica降解PAT过程中的作用。论文的结果如下:1.P.caribbica降解PAT形成中间产物E-ascladiol和Z-ascladiol,E-ascladiol和Z-ascladiol最终被降解成未知产物。经PAT诱导后的P.caribbica胞内酶对PAT的降解能力显著增强,说明P.caribbica降解PAT的过程是可诱导的,PAT刺激后产生的诱导酶参与PAT的降解过程。2.对PAT降解后的中间产物ascladiol和降解终产物的毒性进行了分析,中间产物ascladiol和终产物对大肠杆菌的生长没有抑制作用,而PAT显著抑制了大肠杆菌的生长;中间产物ascladiol和终产物对拟南芥种子的萌发和幼苗生长没有抑制作用,而PAT可显著抑制拟南芥种子的萌发和幼苗生长;中间产物ascladiol和终产物对人食管上皮细胞的活性、活性氧(ROS)的积累、细胞增殖和细胞凋亡没有影响,而PAT可显著抑制细胞活性、刺激ROS积累、导致细胞凋亡。结果表明中间产物ascladiol和终产物对大肠杆菌、拟南芥和人食管上皮细胞均没有毒性。3.基于蛋白质组学技术分析P.caribbica在蛋白表达水平上对PAT的应答调控机制。结果表明:PAT刺激引起119个蛋白的表达水平下调,51个蛋白的表达水平上调。下调蛋白主要参与酵母体内物质代谢和生物合成等生物过程。51个上调的蛋白中有22个蛋白为氧化还原酶,此外,超氧化物歧化酶(SOD)、谷氧还蛋白(GRX)和硫氧还蛋白(TRX)等参与抗氧化应激的蛋白表达被激活。说明,P.caribbica通过激活上述蛋白的表达以应对PAT引起的氧化胁迫,维持酵母细胞内的氧化还原平衡。4.基于转录组学技术分析P.caribbica在基因表达水平上对PAT的应答调控机制。结果表明:PAT刺激引起151个基因的表达水平显著下调,83个基因的表达水平显著上调。显著下调基因主要参与蛋白质生物合成,氨基酸代谢和碳水化合物代谢等生物过程。说明PAT对P.caribbica展现出一定的毒性,在一定程度上抑制了酵母的生命活动。显著上调的基因主要参与氧化还原过程,对化学物质、毒素胁迫应答等生物过程,与蛋白质组结果相似。此外,腺苷甲硫氨酸甲基转移酶基因(S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase1,PcCRG1),抗药性转运蛋白基因(Multidrug resistance protein 1,PcMDR1),黄素单加氧酶(Thiol-specific monooxygenase,PcFMOL1)三个与化学物质清除或转化密切相关的基因的表达水平显著上调。5.对PcCRG1基因在P.caribbica降解PAT中的作用进行了研究。结果表明:PcCRG1基因敲除突变体酵母对PAT的降解作用显著降低,而PcCRG1过量表达酵母对PAT的降解作用明显增强。外源表达Pc CRG1,并纯化得到PcCRG1蛋白。体外生化机制研究发现,PcCRG1蛋白在底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)存在的情况下直接与PAT反应,对其进行降解。