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鹅产蛋量低是制约我国现代鹅业发展的一个瓶颈,培育出高产蛋性能的鹅品种或品系,其商业价值巨大。禽类产蛋量的高低除了受品种、环境及营养等因素影响外,更为重要的是取决于卵巢中卵泡的生长和发育水平。禽类卵泡发育和成熟的过程具有优先等级的特点,是受内、外多因素调控的复杂生理生化过程。因此,开展鹅卵泡发育调控机制的研究意义重大。本实验室在前期研究中,首次发现皖江白鹅（年产蛋50-60枚/只,皖西白鹅和四川白鹅的两系杂交鹅）在卵泡发育早期,BMP/Smad信号通路下游的转录因子Smad9（又称Smad8）高表达,而在卵泡成熟期Smad9基因沉默,暗示Smad9可能参与了鹅卵巢和卵泡等级的发育过程。据此,假设低产鹅如皖西白鹅,其产蛋量低可能是由于Smad9在卵泡成熟期高表达所引起。如果假设成立,推测Smad9可能在调节鹅卵泡优先等级发育和排卵中发挥着关键作用。为验证上述假设和推测,本研究以低产皖西白鹅（年产蛋20-25枚/只）为研究对象,在其产蛋期开展体内、外试验,研究Smad9在卵巢和等级卵泡的定位和表达模式。利用体内注射Smad9基因抑制剂（LDN-193189）和体外干扰Smad9表达等方法研究Smad9表达对产蛋量、卵泡激素受体和血清激素水平以及颗粒细胞激素分泌、激素受体表达和细胞增殖的影响。在这些研究的基础上,通过染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）试验阐明Smad9在禽类卵泡等级发育和调控排卵过程中的具体作用和分子机制。主要研究内容和结果如下:1.为检验课题研究假设和推测是否成立,研究首先选择处于不同生长发育阶段的皖江白鹅和皖西白鹅作为试验对象,获取发育早期卵巢、开产前卵巢、产蛋期卵巢和等级卵泡样品,通过qPCR方法分别对这些样品中的Smad9 mRNA表达进行定量检测并对比分析。结果表明:（1）Smad9基因在鹅卵巢发育的渐进性过程中呈现出一定的表达差异;（2）Smad9基因表达在发育早期卵巢和开产前卵巢中两个鹅种间无明显差异,而在卵巢发育成熟期以及等级卵泡的发育过程中低产皖西白鹅Smad9 mRNA表达均显著高于高产皖江白鹅（P<0.05）。本实验结果初步说明课题研究假设具备一定的实验性基础,同时也表明建立在这一假设基础上的后续探讨具有较强的科学意义。2.在皖西白鹅产蛋期获取卵巢和各等级卵泡,通过形态学观察、H&E染色、免疫组化、qPCR和Western blot等方法对Smad9在卵巢和卵泡的表达进行组织学定位和定量表达研究。结果表明:（1）产蛋期鹅卵巢表面包含有大量的等级前卵泡和排卵前卵泡,等级前卵泡包括小白卵泡（small white follicle,SWF）、大白卵泡（large white follicle,LWF）和小黄卵泡（small yellow follicle,SYF）,排卵前卵泡包括F5、F4…F1（直径由小到大）,等级前卵泡各阶段数量较多,而排卵前卵泡各阶段仅有1枚;（2）H&E染色观察发现鹅等级卵泡颗粒细胞层厚度和密度随卵泡发育呈现规律性变化;（3）免疫组化显示Smad9蛋白在鹅卵巢仅表达于卵泡的颗粒细胞层,在卵巢的其他部分未检测到Smad9的表达;（4）对其定量研究首次发现Smad9在各等级卵泡呈现差异表达,进一步的Western blot结果显示等级卵泡Smad9基因表达在转录和翻译水平是一致的。这些结果表明Smad9可能参与了卵泡的等级建立和维持过程。3.在皖西白鹅开产期,翅静脉注射Smad9基因抑制剂LDN-193189阻抑Smad9表达,利用qPCR和Western blot等方法检测注射LDN-193189后等级卵泡的Smad9和Smad1/5表达变化,采用ELISA方法检测血清中E2、P4、FSH、LH水平以及芳香化酶P450（P450 arom）表达情况,同时记录鹅全期产蛋量。结果表明:（1）体内注射LDN-193189后,Smad9表达在除SYF以外的其他卵泡中均受到显著抑制（P<0.05）,尤其在排卵前卵泡阶段的F3和F2卵泡期抑制极为显著（P<0.01）;（2）Smad1/5 mRNA和FSHR mRNA表达在两组间无显著差异,而LHR mRNA在抑制剂组排卵前卵泡阶段表达变化趋势与对照组差异明显（P<0.05）,表现为逐渐上升趋势,至F1卵泡表现为差异极显著（P<0.01）;（3）产蛋量抑制剂组31.8枚较之于同期对照组（生理盐水组）24.8枚增加了7枚,差异显著（P<0.05）;（4）ELISA检测结果表明,血清中E2和P450 arom浓度抑制剂组显著高于对照组（P<0.05）,而血清中P4、FSH和LH浓度在两组间无显著差异。这些结果表明,Smad9抑制剂可以在体内实现对Smad9表达的调控,抑制Smad9表达可以引起与卵泡发育相关的雌激素合成以及与排卵相关的LHR转录变化,据此本研究认为Smad9基因参与了鹅的产蛋调节过程。这些数据也再次为本研究最初假设——抑制Smad9表达可能会改善低产皖西白鹅的产蛋量提供了实验性依据,然而,关于Smad9基因是通过何种途径和方式影响了鹅卵泡发育和排卵相关因子的表达还尚不清楚。4.众所周知,卵泡的生长发育与卵泡颗粒细胞的增殖、分化及其内分泌功能密切相关。为阐明Smad9基因在鹅卵泡发育和产蛋过程中的生物学作用,研究以SYF卵泡颗粒细胞作为研究对象进行原代培养,开展体外研究。根据GenBank上鹅的Smad9基因序列（XM013192591.1）设计6对Smad9-siRNA干扰序列,通过验证筛选后转染鹅原代培养的卵泡颗粒细胞。已有研究表明,BMP-4可以诱导Smad9的表达,因此试验同期采用BMP-4、BMP-4/LDN-193189、Smad9-siRNA分别诱导原代培养颗粒细胞。结果表明与对照组相比:（1）Smad9-siRNA组有效沉默了颗粒细胞Smad9表达,颗粒细胞FSHR、LHR和CYP19A1 mRNA表达显著下调（P<0.05）,细胞培养上清中的E2、P4、FSH、LH和P450 arom浓度显著下降（P<0.05）,细胞增殖能力也显著降低（P<0.05）;（2）BMP-4组显著刺激了颗粒细胞Smad1/5/9表达（P<0.05）,但对激素合成、激素受体表达以及细胞增殖能力均无显著影响;（3）BMP-4/LDN-193189组显著阻抑了Smad9表达,颗粒细胞LHR和CYP19A1 mRNA表达显著增加（P<0.05）,细胞上清中E2和P450 arom浓度显著增加（P<0.05）,细胞增殖能力也显著增强（P<0.05）。这些结果提示,采用抑制剂LDN-193189部分阻断Smad9表达有利于颗粒细胞的生长发育和功能发挥,除此之外,本研究结果也暗示Smad9在调控鹅卵泡发育过程中可能存在某种剂量效应。5.在体内试验中,Smad9表达被LDN-193189抑制后促进了鹅的产蛋,为阐明这一分子机制,本研究采用免疫荧光方法对Smad9在颗粒细胞的表达进行亚细胞定位,随后在此基础上开展ChIP试验分析。结果表明:（1）Smad9位于颗粒细胞的细胞质,而其活性形式（磷酸化的Smad9蛋白）p-Smad9位于细胞质和细胞核;（2）ChIP分析显示p-Smad9可以结合在促黄体素受体（luteinizing hormone receptor,LHR）的启动子区,实现对LHR转录的调控。大量研究已经表明,促黄体素（LH）在卵泡的生长发育、优势化和排卵等方面发挥重要的生理功能,而LH功能的发挥必须借助于卵泡上LHR的介导,尤其在卵泡的优势化和排卵过程中具有重要的意义;（3）本研究也发现Smad9调控LHR转录与其表达量密切相关。与空白对照组相比,LHR转录活性在Smad9过表达时无明显变化,在Smad9被干扰抑制后显著下降（P<0.05）,但在Smad9被抑制剂阻抑后显著增加（P<0.05）,这些结果均表明本研究在体外实验中发现的这种剂量效应是真实存在的。本研究首次获得了Smad9基因在鹅等级卵泡的差异表达信息。针对该基因的功能研究结果表明:（1）Smad9可能是通过影响颗粒细胞的增殖和内分泌功能以及生殖激素受体LHR的转录进而调控鹅卵泡的等级发育和排卵;（2）Smad9基因参与这一调控过程具有剂量效应。后续研究可通过调节Smad9基因表达来调控鹅的卵泡等级发育和排卵,为提高鹅产蛋量提供新的策略。未来也许可以将Smad9作为候选基因,为选择和培育高产鹅群提供相关理论基础。