核桃(Juglans regia.L)遗传转化体系及嫁接砧穗间基因转导探究

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核桃(Juglans regia.L)作为果、木兼优的经济树种,因其树形高大,生境多为山地,繁殖周期长等限制因素,培育具有矮化特性且抗性增强的砧木品种具有重大意义。本试验利用农杆菌介导法,将以山核桃(Carya cathayensis)GA20ox基因构建的RNA干扰载体转化至核桃体胚中,并诱导出具矮化特性的核桃植株,为选育矮化型砧木提供可行的方法。在微嫁接试验中,利用DsRED转基因核桃苗的荧光特性进行嫁接砧穗间转基因信号传递问题的研究,为探究功能基因在嫁接砧穗间的传递机制奠定基础,也为进一步研究基因信号传递的分子机制提供有利平台。本研究的主要结果如下:(1)核桃遗传转化体系建立:DKW培养基作为核桃体胚培养的基本培养基,完全能够满足RR4核桃体胚的正常生长繁殖,每7-10天进行一次继代培养,能保持体胚最好的生长状态。核桃次生体胚多直接发生于合子胚胚轴和子叶表面,体胚发育经历球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚四个阶段;农杆菌浓度OD600为0.4时侵染体胚20min以及OD600为0.5侵染15min时均能得到较好的侵染效果,经GUS及qRT-PCR检测后得到阳性体胚和植株,体胚和植株中GA20ox基因表达量较对照明显下降且转化株矮于对照株,说明成功获得了具有矮化表型的转基因核桃植株。(2)微型嫁接体系建立:体视荧光显微镜下可观察到DsRED转基因苗显示红色荧光而对照苗未显示出荧光;DsRED转基因苗和对照苗筛选培养一个月后,转基因苗正常生长,而对照苗慢慢变黑死亡;提取转基因及对照苗的DNA后进行PCR检测显示试验选取的转基因苗的DsRED基因都有较高的表达量且表达稳定,对照苗中没有DsRED基因的表达;利用劈接的方式将RR4对照核桃苗嫁接于DsRED转基因砧木上,两周后嫁接苗的砧木和接穗可以完全愈合;qRT-PCR的结果显示,对照苗接穗中检测到了转基因砧木中的DsRED,不过在体视荧光显微镜下未观察到与砧木相似的明亮的红色荧光。
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