论文部分内容阅读
第一部分:TRPM8诱导正常鼻黏膜上皮细胞发生上皮间质转化的研究目的M型瞬时感受器电位蛋白8（melastatin-related transient receptor potential 8,TRPM8）是TRP家族蛋白通道成员之一,主要作用为冷刺激瞬时感受通道。研究发现TRPM8在支气管上皮细胞、鼻黏膜上皮细胞中均有表达。另有一些研究人员发现在乳腺癌中过多表达的TRPM8会诱导上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）这一过程促进肿瘤发展。当TRPM8表达上调时,气道上皮细胞是否发生EMT过程尚未有研究证实。故本课题拟探讨正常鼻粘膜上皮细胞过表达TRPM8后是否会发生EMT以及调控机制。方法利用TRPM8特异性激动剂WS-12刺激人鼻腔上皮细胞系RPMI 2650,分别设置不同浓度和不同时间梯度以确定实验条件后,使用实时定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫荧光技术检测刺激后细胞中TRPM8以及EMT相关标志物的表达。利用相同条件下的WS-12刺激体外培养的人鼻黏膜正常原代上皮细胞后,通过显微镜观察细胞形态变化,并利用蛋白免疫印迹的方法检测TRPM8以及EMT相关标志物表达。通过蛋白免疫印迹检测ws-12、Smad3抑制剂SIS3和TGF-β1刺激鼻上皮细胞后细胞中TRPM8、EMT相关标志物和Smad3、p-Smad3表达水平,并通过ELISA检测ws-12刺激后上皮细胞培养基上清中TGF-β1表达水平。结果通过WS-12刺激后RPMI 2650以及人鼻黏膜正常原代上皮细胞中TRPM8的表达均升高,同时EMT相关标志物中E-cad表达降低,而α-SMA、vimentin表达升高,提示促进了上皮发生EMT过程。当给予WS-12刺激后人鼻黏膜正常原代上皮细胞由卵圆形转变为长梭形,也提示了发生了细胞形态学改变,进一步证实发生了EMT过程。上调了TRPM8的表达后加入SIS3后发现并未发生EMT,提示Smad3可能是TRPM8调控EMT的下游通路,但TRPM8表达上调后并未影响TGF-β1的表达,提示TRPM8可能是通过其他途径影响Smad3磷酸化从而调控EMT。结论体外实验验证了TRPM8可以诱导鼻黏膜上皮细胞EMT过程。同时TRPM8可能通过Smad3通路调控上皮细胞发生EMT。TRPM8诱导正常鼻黏膜上皮细胞发生EMT这一特性可能与和EMT关系密切的鼻部疾病的发病机制有关。第二部分:TRPM8在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达及其作用机制目的鼻粘膜上皮细胞是上呼吸道抗外界刺激的有力屏障。当病原体或有害物质侵害鼻粘膜上皮并对其完整性造成损害时,会引起鼻腔、鼻窦黏膜病理改变。近年来研究发现瞬时受体电位通道M型8（melastatin-related transient receptor potential 8,TRPM8）是位于胞膜上的阳离子通道蛋白,分布广泛。可通过介导钙离子内流参与细胞的分子生物学异常改变。前期研究结果发现TRPM8可诱导鼻上皮细胞发生上皮间质转化。慢性鼻窦炎伴息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSw NP）是耳鼻喉科常见病之一。既往研究发现CRSw NP患者的息肉上皮有发生EMT,但其具体机制未知。本课题拟探讨TRPM8在CRSw NP中的定位及表达情况,验证TRPM8是否与息肉上皮细胞发生的EMT相关。并通过动物模型进一步验证TRPM8对息肉形成的影响。方法通过R语言对GEO数据库中筛选得到的鼻息肉相关芯片进行聚类分析,观察TRPM8所在的TRP家族蛋白表达情况。利用免疫组织化学技术检测临床样本组织中TRPM8的表达以及定位情况,通过体外培养CRSw NP患者的人鼻黏膜原代上皮细胞,进行免疫荧光验证。随后敲低培养的息肉上皮细胞中TRPM8的表达水平后,利用实时定量PCR和蛋白免疫印迹检测EMT相关指标的表达水平,并利用蛋白免疫印迹检测p Smad3表达情况。收取正常组,慢性鼻窦炎不伴息肉（CRSs NP）组和CRSw NP组临床标本制备成组织匀浆后加入RPMI 2650细胞中刺激24h,随后利用蛋白免疫印迹技术检测TRPM8蛋白表达。随机挑选5组6-8周龄的c57/BL6J小鼠,每组5-7只。一组（A组）作为正常对照组,不给予任何药物干预。其他四组使用卵清蛋白（OVA）+氢氧化铝（Alum）的PBS混悬液腹腔注射5天后,使用OVA对小鼠进行滴鼻一周,每天1次,随后每周3次持续4周。一组（B组）随后用PBS滴鼻,每周3次持续8周;一组（C组）用OVA+金黄色葡萄球菌菌毒素（SEB）滴鼻,每周3次持续8周;一组（D组）用OVA+SEB滴鼻+TRPM8特异性抑制剂AMG-333腹腔注射每周3次持续8周;一组（E组）用OVA+SEB滴鼻+地塞米松腹腔注射每周3次持续8周。造模结束后将小鼠鼻-鼻窦黏膜组织完整取出,通过苏木精-伊红染色观察每组间息肉样改变的部位并统计息肉样变部位的数目,通过ELISA检测小鼠血清抗OVA的免疫球蛋白E表达水平。结果芯片分析显示TRPM8在CRSw NP的息肉组织中的表达相较于CRSw NP的钩突组织是明显升高的（P＜0.01）。临床样本检测后发现与正常鼻黏膜组织相比,TRPM8在嗜酸浸润性鼻息肉以及非嗜酸浸润性鼻息肉中表达明显上调（P＜0.05）,同时主要表达在上皮细胞。CRSs NP患者上皮细胞中TRPM8的表达与正常对照组无差异（P＞0.05）。通过加入正常对照组,CRSs NP和CRSw NP组织匀浆刺激24h后RPMI 2650细胞中TRPM8的表达发生改变。相较于正常对照组和CRSs NP组,CRSw NP组匀浆刺激24h后的RPMI 2650细胞中TRPM8表达明显增高,提示CRSw NP的炎症环境会促进TRPM8在上皮中的表达。敲低鼻息肉上皮细胞中TRPM8表达后发现与EMT相关的指标中上皮标志物E-cad表达升高,而间质标志物α-SMA、vimentin表达降低,同时p-Smad3表达也下调。动物实验中,与正常对照组小鼠相比,鼻息肉模型小鼠鼻黏膜组织出现明显息肉样变,黏膜增厚褶皱增多、上皮纤毛排列紊乱。血清OVA-s Ig E水平也升高。TRPM8抑制剂治疗组与地塞米松治疗组地小鼠虽然也出现炎性改变,但息肉样变部位数量少于鼻息肉模型组。TRPM8抑制剂治疗组与地塞米松治疗组的小鼠血清中OVA-s Ig E的表达水平也要低于息肉组小鼠。提示抑制TRPM8表达后可抑制鼻息肉形成。结论TRPM8在CRSw NP上皮细胞中表达上调,下调其表达后可能可以改善息肉上皮细胞的EMT过程。动物实验验证了抑制TRPM8表达后确实对息肉发生发展有一定抑制作用。TRPM8可为慢性鼻窦炎伴鼻息肉的治疗策略提供一个新的方向。