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三阴性乳腺癌是乳腺癌的一个特殊分子亚型,是指雌激素受体(estrogen receptor,ER),孕激素受体(progesterone receptor,PR),人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)均不表达的乳腺癌,其独特的分子分型决定了其特殊的临床病理特征,包括发病年龄早,组织学分级高,侵袭性强,复发转移率高,中位生存时间短,死亡率高等。目前乳腺癌的治疗手段主要包括手术、化疗、放疗及针对ER和PR的内分泌治疗和针对HER-2靶点的靶向治疗,由于三阴性乳腺癌缺乏ER、PR和HER-2表达,临床上除了手术、化疗、放疗,缺乏其他有效的治疗手段。寻找针对三阴性乳腺癌治疗有效的分子靶点是探索未来三阴性乳腺癌治疗的重要策略。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类长度约为20~25个核苷酸的内源非编码单链RNA,广泛存在真核生物内。它主要通过m RNA 3’-非翻译区和miRNA 5’端的部分配对,发挥基因沉默和转录后修饰调节基因表达的作用。目前研究已经表明,多种miRNAs参与调节恶性肿瘤的发生演变过程。miR-153作为一个保守的miRNA,被认为是三阴性乳腺癌的潜在分子标志物。然而,miR-153对三阴性乳腺癌临床生物学行为和细胞生物学行为的影响目前尚不明确。E盒结合锌指同源蛋白2(Zinc finger E-box-binding homeobox 2,ZEB2)是一种细胞核转录因子,在真核生物中具有多种重要功能,其最重要的功能是诱导肿瘤细胞由恶性潜能较弱的上皮表型向恶性潜能更强的间质表型转化,从而失去上皮标志物,获得间质标志物,这个过程定义为上皮间质转化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)。在这个转化程序中,细胞的结构、极性、粘附性、迁移能力的改变促进了包括三阴性乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的进展。本研究以三阴性乳腺癌组织和三阴性乳腺癌细胞株为研究对象,应用多项技术和方法,分析探讨了miR-153对三阴性乳腺癌临床生物学行为和细胞生物学行为的影响及其分子机制,为寻找三阴性乳腺癌临床诊断和治疗的生物靶点提供理论依据。本研究三部分内容具体如下:第一部分MiR-153与三阴性乳腺癌患者临床病理学特性及预后关系的研究目的:1.检测miR-153在三阴性乳腺癌组织及其相应的癌旁组织中的表达水平,分析检测结果,探讨其表达变化的意义。2.检测分析三阴性乳腺癌患者组织中miR-153的表达水平与临床病理特征的关系,并分析影响三阴性乳腺癌患者预后的可能危险因素及miR-153的表达水平与三阴性乳腺癌患者无病生存期和总生存期的关系,为判断miR-153对三阴性乳腺癌患者预后的影响提供理论依据。方法:1.应用RT-q PCR方法检测miR-153在三阴性乳腺癌组织及其相应的癌旁组织中的表达水平。2.应用χ2检验统计分析三阴性乳腺癌组织中miR-153的表达水平与年龄、肿瘤部位、乳腺癌家族史、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期、癌栓的关系。3.应用Cox’s比例风险回归模型对影响三阴性乳腺癌患者预后可能的危险因素进行单因素和多因素分析。4.应用Kaplan-Meier方法分析miR-153的表达水平与三阴性乳腺癌患者无病生存期和总生存期的关系。结果:1.MiR-153在三阴性乳腺癌组织中的表达水平明显低于其相应的癌旁组织(P<0.01)。2.MiR-153的表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期存在相关性(P<0.05),与年龄、肿瘤部位、家族史、组织学分级、癌栓无相关性(P>0.05)。3.单因素分析结果显示,肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、癌栓、miR-153的表达水平是三阴性乳腺癌患者无病生存期的危险因素(P<0.05);多因素分析结果显示,TNM分期、miR-153的表达水平影响三阴性乳腺癌患者的无病生存期(P<0.05)。4.单因素分析结果显示,肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、癌栓、miR-153的表达水平是三阴性乳腺癌患者总生存期的危险因素(P<0.05);多因素分析结果显示,TNM分期、miR-153的表达水平影响三阴性乳腺癌患者的总生存期(P<0.05)。5.MiR-153高表达的三阴性乳腺癌患者的无病生存期优于低表达者(P<0.05)。6.MiR-153高表达的三阴性乳腺癌患者的总生存期优于低表达者(P<0.05)。小结:MiR-153在三阴性乳腺癌组织中表达水平降低,三阴性乳腺癌组织中miR-153的表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TMN分期存在相关性,miR-153高表达的三阴性乳腺癌患者的无病生存期和总生存期优于低表达者。第二部分MiR-153对三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力影响的研究目的:1.检测miR-153在三阴性乳腺癌细胞株和正常乳腺上皮细胞株中的表达水平,分析检测结果,探讨其表达变化的意义。2.比较转染miR-153 mimics和miR-NC的三阴性乳腺癌细胞中miR-153的表达水平,观察三阴性乳腺癌细胞在过表达miR-153后增殖、侵袭、迁移能力的变化,探讨miR-153对三阴性乳腺癌恶性生物学行为的影响。方法:1.应用RT-q PCR方法检测miR-153在三阴性乳腺癌细胞株及正常乳腺上皮细胞株中的表达水平。2.应用RT-q PCR方法检测转染miR-153 mimics和miR-NC的三阴性乳腺癌细胞中miR-153的表达水平。3.应用CCK-8方法检测过表达miR-153的三阴性乳腺癌细胞增殖能力的变化。4.应用Transwell侵袭实验检测过表达miR-153的三阴性乳腺癌细胞侵袭能力的变化。5.应用伤口愈合实验检测过表达miR-153的三阴性乳腺癌细胞迁移能力的变化。结果:1.MiR-153在三阴性乳腺癌细胞中的表达水平明显低于正常乳腺上皮细胞(P<0.01)。2.转染miR-153 mimics的三阴性乳腺癌细胞中miR-153的表达水平明显增高(P<0.001)。3.过表达miR-153的三阴性乳腺癌细胞的增殖能力减弱(P<0.01)。4.过表达miR-153的三阴性乳腺癌细胞的侵袭能力减弱(P<0.01)。5.过表达miR-153的三阴性乳腺癌细胞的迁移能力减弱(P<0.01)。小结:MiR-153在三阴性乳腺癌细胞中表达水平降低,转染miR-153的三阴性乳腺癌细胞的增殖能力,侵袭能力和迁移能力明显减弱。第三部分MiR-153对三阴性乳腺癌生物学行为影响的机制研究目的:1.应用生物信息学网站预测miR-153下游的分子靶点,检测三阴性乳腺癌组织及其相应的癌旁组织中ZEB2蛋白的表达水平,从组织水平验证miR-153与ZEB2的关系。2.从细胞水平分析miR-153与ZEB2的关系,进一步分析三阴性乳腺癌中miR-153对ZEB2和EMT标志物表达水平的影响及同时过表达miR-153和ZEB2对三阴性乳腺癌恶性生物学行为及EMT的影响,为研究miR-153对三阴性乳腺癌生物学行为影响的机制提供实验依据。方法:1.应用生物信息学网站预测miR-153下游的直接靶基因。2.应用免疫组织化学方法检测ZEB2在三阴性乳腺癌组织及其相应的癌旁组织中的表达,并分析三阴性乳腺癌组织中miR-153的表达水平与ZEB2蛋白表达水平之间的关系。3.应用双荧光素酶报告基因实验验证预测的靶基因。4.应用RT-q PCR和Western blot分别检测过表达miR-153的三阴性乳腺癌细胞中ZEB2表达水平的变化。5.应用RT-q PCR和Western blot分别检测过表达miR-153的三阴性乳腺癌细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达水平的变化。6.对同时过表达miR-153和ZEB2的三阴性乳腺癌细胞通过CCK-8方法观察其增殖能力的变化。7.对同时过表达miR-153和ZEB2的三阴性乳腺癌细胞通过Transwell侵袭实验观察其侵袭能力的变化。8.对同时过表达miR-153和ZEB2的三阴性乳腺癌细胞通过Western blot方法观察E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及ZEB2表达水平的变化。结果:1.ZEB2被预测是miR-153下游的靶基因。2.ZEB2的阳性染色主要位于三阴性乳腺癌组织的细胞质和细胞膜,miR-153的表达水平和ZEB2蛋白的表达水平呈负相关(P<0.001)。3.MiR-153对野生型ZEB2质粒荧光素酶活性具有抑制作用(P<0.01)。4.MiR-153抑制三阴性乳腺癌细胞中ZEB2的表达水平(P<0.01)。5.MiR-153抑制三阴性乳腺癌细胞中N-cadherin和Vimentin的表达水平,促进E-cadherin的表达水平(P<0.01)。6.过表达ZEB2能够逆转过表达miR-153的三阴性乳腺癌细胞的增殖能力(P<0.01)。7.过表达ZEB2能够逆转过表达miR-153的三阴性乳腺癌细胞的侵袭能力(P<0.01)。8.过表达ZEB2能够逆转过表达miR-153的三阴性乳腺癌细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及ZEB2的表达水平(P<0.05)。小结:ZEB2被预测是miR-153下游的靶基因,miR-153在三阴性乳腺癌中可能负向调节ZEB2的表达,过表达miR-153能够抑制三阴性乳腺癌细胞ZEB2的表达水平和EMT过程,过表达ZEB2能够逆转miR-153对三阴性乳腺癌细胞恶性生物学行为的抑制效应。结论:1.MiR-153在三阴性乳腺癌组织中表达水平降低,三阴性乳腺癌组织中miR-153的表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TMN分期存在相关性,miR-153高表达的三阴性乳腺癌患者的无病生存期和总生存期优于低表达者,推测过表达miR-153能够改善三阴性乳腺癌患者的预后。2.MiR-153在三阴性乳腺癌细胞中表达水平降低,转染miR-153的三阴性乳腺癌细胞的增殖能力,侵袭能力和迁移能力明显减弱,推测过表达miR-153能够抑制三阴性乳腺癌细胞的恶性生物学行为。3.ZEB2被预测是miR-153下游的靶基因,miR-153在三阴性乳腺癌中可能负向调节ZEB2的表达,过表达miR-153能够抑制三阴性乳腺癌细胞ZEB2的表达水平和EMT过程,过表达ZEB2能够逆转miR-153对三阴性乳腺癌细胞恶性生物学行为的抑制效应,推测miR-153可能通过靶向作用于ZEB2/EMT轴抑制三阴性乳腺癌的生物学行为。