背景:白癜风是一种杀伤性CD8+T细胞特异性破坏黑素细胞导致色素脱失的慢性自身免疫性常见皮肤病。皮损易发生于面颈手足等暴露部位,引起容貌焦虑,严重降低患者的生活质量,治疗需求日益增长。近年来的研究认为在遗传易感性背景下,皮肤局部微环境改变使黑素细胞抗原暴露被抗原提呈细胞识别并递呈给外周免疫组织中的CD8+T细胞,促使其活化为黑素细胞特异性CD8+T细胞,进一步在皮肤细胞分泌的大量趋化因子诱导下,黑素细胞特异性CD8+T细胞被精细调控迁移至黑素细胞定植部位进而特异性杀伤黑素细胞,形成白斑。其中在IFN-γ等炎症因子作用下角质形成细胞来源的趋化因子CXCL9和CXCL10的过度表达诱导CXCR3+CD8+T细胞皮肤迁移,同时这些CD8+T细胞释放大量IFN-γ等效应分子进一步诱导角质形成细胞分泌趋化因子形成的正反馈趋化信号环路是白癜风发生发展的关键机制,因此也是白癜风治疗药物需要靶向的重要环节。去甲泽拉木醛（demethylzeylasteral,T-96）是传统中药雷公藤根皮中提取的活性单体之一,多项研究已证实其具有很强的免疫抑制、抗炎及抗病毒等药理作用,在狼疮性肾炎、异体肾移植及类风湿性关节炎的体内研究中均取得很好的疗效。体外研究发现去甲泽拉木醛在0.5μg/m L浓度时就可显著抑制有丝分裂原刀蛋白A刺激作用下小鼠脾脏中分离提取免疫细胞的增殖能力,且其体外免疫抑制作用与1.0μg/m L的环孢素相当,与其它雷公藤活性单体相比,去甲泽拉木醛具有低毒性的优势,因此被认为是最有希望开发成为新型免疫抑制剂的天然化合物之一。此外我国李铁男教授率先在临床上使用雷公藤多甙片（每次20 mg,每天2次）治疗进展期白癜风患者时,发现雷公藤治疗具有很好的有效性和安全性,但雷公藤的单体有效成分在白癜风治疗中的作用及理论机制研究尚处于空白状态。我们课题组致力于将白癜风发病机制研究成果转化为临床实用的治疗方法,基于雷公藤在我国白癜风治疗中已经取得的良好疗效及其单体去甲泽拉木醛极强的免疫抑制、抗炎和低毒性等特点,我们提出本研究科学假说:去甲泽拉木醛可能一方面通过抑制CD8+T细胞的增殖、活化和效应功能,另一方面通过降低炎症应激下角质形成细胞来源的趋化因子从而阻断CD8+T细胞的皮肤迁移,最终保护黑素细胞免受损伤,起到治疗白癜风的作用。目的:1.探讨去甲泽拉木醛在白癜风患者CD8+T细胞中的免疫调控作用。明确去甲泽拉木醛对白癜风患者CD8+T细胞增殖、活化和效应功能的抑制作用及潜在机制。2.明确去甲泽拉木醛对炎性应激下角质形成细胞生成和分泌趋化因子的作用及具体分子机制,明确去甲泽拉木醛对白癜风患者CD8+T细胞膜表面CXCR3的表达,进一步检测去甲泽拉木醛处理角质形成细胞上清对白癜风患者CXCR3+CD8+T细胞的趋化作用。3.构建白癜风动物模型,评估去甲泽拉木醛在白癜风小鼠模型中的治疗作用,为白癜风治疗提供新策略。方法:1.明确去甲泽拉木醛作用于人CD8+T细胞的安全作用浓度。收集年龄性别匹配的白癜风患者和正常对照外周血,分离PBMC分选CD8+T细胞,使用CCK8实验检测去甲泽拉木醛在白癜风患者和健康对照外周血中CD8+T细胞的IC50值,进一步缩小浓度梯度筛选去甲泽拉木醛作用于CD8+T细胞的安全作用浓度。2.明确去甲泽拉木醛对人CD8+T细胞增殖、活化和效应功能的影响。收集年龄性别匹配的白癜风患者和健康对照外周血,分选CD8+T细胞。首先通过CFSE染色联合流式细胞测定法检测去甲泽拉木醛对CD8+T细胞增殖水平的影响,其次通过胞膜流式细胞术检测去甲泽拉木醛预处理对CD8+T细胞早期活化标志物CD69表达的影响,进一步胞内细胞流式术检测去甲泽拉木醛预处理对CD8+T细胞胞内炎症因子IFN-γ和杀伤效应分子Gzm B及PRF表达的影响。3.探讨去甲泽拉木醛对白癜风患者CD8+T细胞的作用机制。对去甲泽拉木醛进行生物素标记合成T-96Bio,使用链霉亲和素磁珠下拉T-96Bio在白癜风患者CD8+T细胞蛋白裂解液中的结合蛋白,随后对结合蛋白质谱结果进行分析,结合白癜风相关文献筛选出与白癜风CD8+T细胞功能相关的结合蛋白,进一步用计算机分子模拟的方法进行验证并解析去甲泽拉木醛与结合蛋白可能的结合位点,最后使用流式细胞术对结合蛋白功能进行验证。4.明确去甲泽拉木醛在炎症应激模型中角质形成细胞的作用及具体分子机制。首先我们使用CCK8实验检测去甲泽拉木醛在人原代角质形成细胞和细胞系Ha Ca T中的安全作用浓度。采用pull down实验联合质谱分析方法得到去甲泽拉木醛在IFN-γ处理下原代角质形成细胞蛋白裂解液中的结合蛋白,通过与对照组生物素结合蛋白进行差异分析筛选出与白癜风发生发展相关蛋白,进一步使用分子对接技术解析去甲泽拉木醛与靶蛋白的结合位点。采用q RT-PCR、细胞流式术、蛋白印迹及细胞免疫荧光等方法检测去甲泽拉木醛对结合分子m RNA和蛋白水平的影响,进一步通过q RT-PCR和ELISA等方法检测去甲泽拉木醛对下游趋化因子的生成和分泌作用。5.明确去甲泽拉木醛对白癜风患者CD8+T细胞膜表面趋化因子受体CXCR3的作用,明确去甲泽拉木醛预处理炎症应激下角质形成细胞分泌上清对白癜风患者CXCR3+CD8+T细胞的趋化作用。收集白癜风患者外周血,分选CD8+T细胞,通过胞膜细胞流式术的方法检测IL-2诱导下白癜风患者CD8+T细胞膜表面CXCR3的影响,同时检测去甲泽拉木醛预处理后对CXCR3表达的影响。通过transwell实验分别检测不同处理后炎症应激下角质形成细胞分泌上清对CXCR3+CD8+T细胞的趋化作用。6.构建白癜风动物模型。总结分析文献中现有白癜风动物模型及本课题研究目的,构建适合本研究的白癜风小鼠模型。我们通过在C57BL/6老鼠皮下注射黑素瘤细胞生成黑素瘤使小鼠体内产生针对黑素细胞的特异性CD8+T细胞,然后腹腔注射CD4抗体消除Treg对CD8+T细胞的免疫抑制调节作用,随后切除皮内黑素瘤,使CD8+T细胞攻击小鼠体内正常黑素细胞,进而出现色素脱失。在不同时间对小鼠尾巴皮肤进行取样,使用全皮免疫荧光染色的方法对白癜风小鼠模型进行鉴定与评估。此白癜风动物模型与人白癜风的免疫学发病机制很类似,都是杀伤性CD8+T细胞特异性攻击正常黑素细胞形成白斑,可用于白癜风免疫学发病机制和转化研究。7.证实去甲泽拉木醛在白癜风小鼠模型中的治疗作用。在前期白癜风动物模型构建的基础上,使用低高剂量去甲泽拉木醛,每周3次,腹腔注射给药方法对成功构建的白癜风小鼠进行治疗,拍照记录白癜风小鼠尾巴皮肤颜色的变化,全皮免疫荧光染色技术检测白癜风小鼠尾巴表皮CD8+T细胞和黑素细胞的浸润情况,评估去甲泽拉木醛在白癜风小鼠模型中的治疗作用。结果:1.去甲泽拉木醛作用于人CD8+T细胞的安全浓度为1.0μM。细胞毒性检测实验结果显示去甲泽拉木醛在白癜风患者CD8+T细胞中的IC50值为4.54μM,在健康对照CD8+T细胞中的IC50值为6.32μM,进一步设置不同浓度梯度处理白癜风患者和健康对照CD8+T细胞的结果表明1.0μM是去甲泽拉木醛处理人CD8+T细胞的安全浓度。2.去甲泽拉木醛抑制人CD8+T细胞的增殖、活化和效应功能。CFSE染色联合流式细胞术的结果显示去甲泽拉木醛可显著抑制CD8+T细胞的增殖;胞膜流式细胞术结果表明去甲泽拉木醛显著降低CD8+T细胞膜表面CD69表达;胞内流式细胞术结果表明去甲泽拉木醛显著降低CD8+T细胞胞内效应分子IFN-γ、Gzm B和PRF表达。同时我们以JAK抑制剂托法替尼作为阳性对照比较了去甲泽拉木醛与托法替尼的免疫抑制作用,结果表明去甲泽拉木醛与托法替尼对白癜风患者CD8+T细胞增殖,活化和效应功能的抑制作用相当。3.去甲泽拉木醛降低白癜风患者CD8+T细胞的JAK3-STAT5通路活化。Pull down实验联合蛋白质谱分析技术得到去甲泽拉木醛在白癜风患者CD8+T细胞蛋白裂解液中的结合蛋白,差异分析及GO结果显示去甲泽拉木醛参与调控CD8+T细胞的效应功能,JAK3是其结合蛋白之一,计算机分子模拟技术发现去甲泽拉木醛与JAK3蛋白质结构（PDB:5TOZ）可以通过碳氢键、Pi-硫键、传统氢键以及烷基键进行结合。流式细胞术结果表明去甲泽拉木醛可以剂量依赖的方式抑制CD8+T细胞在IL-2活化状态下JAK3及其下游基因STAT5蛋白的磷酸化水平。该部分结果提示去甲泽拉木醛可能通过JAK3-STAT5信号影响白癜风患者CD8+T细胞的效应功能。4.去甲泽拉木醛通过JAK2-STAT1通路抑制炎症应激下角质形成细胞中CXCL9和CXCL10的生成及表达。细胞毒性实验结果表明去甲泽拉木醛在角质形成细胞和Ha Ca T细胞系中的IC50分别为12.02μM和15.08μM,浓度梯度实验最后确定安全作用浓度为1.0μM。Pull down实验联合质谱分析结果表明去甲泽拉木醛在IFN-γ处理下角质形成细胞蛋白裂解液中结合蛋白包含JAK2,计算机分子模拟技术进一步证实了二者可以结合并预测了可能的结合位点。流式细胞术和蛋白印迹结果表明去甲泽拉木醛预处理可在15分钟时间点显著降低IFN-γ诱导的JAK2磷酸化,q RT-PCR、蛋白印迹和细胞免疫荧光结果证实去甲泽拉木醛可降低JAK2下游STAT1的m RNA和蛋白表达,并抑制STAT1入核发挥转录作用。q RT-PCR和ELISA实验结果显示去甲泽拉木醛显著降低炎症应激下角质形成细胞内CXCL9和CXCL10的m RNA表达和蛋白分泌水平,过表达JAK2可部分逆转此现象,同时我们发现去甲泽拉木醛和托法替尼对JAK2-STAT1-CXCL9/CXCL10信号的抑制作用相当。上述结果表明去甲泽拉木醛作用于IFN-γ模拟的炎症应激角质形成细胞时,可通过靶向JAK2-STAT1通路降低CXCL9和CXCL10的m RNA和蛋白表达。5.去甲泽拉木醛降低CD8+T细胞膜表面CXCR3的表达,并阻断CXCR3+CD8+T细胞的趋化。流式细胞术结果表明去甲泽拉木醛可降低白癜风患者外周血中CD8+T细胞膜表面CXCR3的表达。进一步体外Transwell实验结果表明IFN-γ刺激下的角质形成细胞可诱导CXCR3+CD8+T细胞趋化至下室,而去甲泽拉木醛和托法替尼预处理后的上清均可显著抑制此趋化作用,与添加CXCL9和CXCL10中和抗体的抑制作用相当。6.成功构建白癜风动物模型。给形成皮下黑素瘤的小鼠使用CD4抗体清除Treg和切除黑素瘤,活化诱导黑素细胞特异性CD8+T细胞攻击正常黑素细胞构建白癜风小鼠模型。我们使用全皮荧光染色观察到第28天左右CD8+T细胞开始浸润到毛囊周围,随着时间推移CD8+T细胞在表皮浸润数目越来越多,并持续特异性杀伤黑素细胞,导致黑素细胞被破坏,越来越少,35至50天左右尾巴皮肤可观察到白斑并逐渐扩展。7.去甲泽拉木醛改善白癜风小鼠色素脱失,降低表皮CD8+T细胞浸润。在建模28后开始治疗,腹腔注射低剂量2.5 mg/kg和高剂量5.0 mg/kg去甲泽拉木醛,隔天1次,共5周治疗后,发现低高剂量均可改善白癜风小鼠脱色程度,高剂量5.0 mg/kg给药效果更好,与托法替尼用药组疗效相当。全皮荧光染色可见去甲泽拉木醛和托法替尼治疗组与对照组相比均表现为CD8+T细胞浸润显著减少,黑素细胞未减少。以上体内实验结果证实去甲泽拉木醛在白癜风小鼠模型中具有很好的治疗作用。结论:通过本课题的研究我们发现去甲泽拉木醛可抑制CD8+T细胞的增殖、活化及效应功能,抑制CD8+T细胞活化状态下JAK3-STAT5通路,此外去甲泽拉木醛可降低活化CD8+T细胞膜表面CXCR3的表达,降低炎症应激下角质形成细胞中JAK2-STAT1信号下调CXCL9和CXCL10的表达,进而阻断CXCR3+CD8+T细胞趋化。体内研究发现去甲泽拉木醛可改善白癜风动物模型病情进展,降低皮肤局部CD8+T细胞浸润。我们的研究明确了去甲泽拉木醛在白癜风的潜在治疗作用和可能的分子机制,为白癜风及其它自身免疫性疾病的临床治疗提供了新思路。