论文部分内容阅读
目的：肾脏肥大是多种肾脏疾病（如糖尿病肾病和残余肾）早期重要的病理表现，与肾脏疾病的预后可能有密切关系。最近的研究表明，肾脏局部肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system，RAS）激活在肾脏疾病慢性进展中起十分关键的作用，但是其详细作用机制仍是学术界研究的热点问题。晚近研究提示，血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是导致肾脏肥大的一个重要调节因子，但是其确切机制仍不明了。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）是新近发现的一个重要的致纤维化因子，在以增殖性病变为主的肾脏疾病中表达增高。CTGF是否介导AngⅡ所诱导的肾脏肥大?其可能的机制是什么?这些问题国内外尚未见研究报道。本研究主要通过体外细胞培养和肾脏肥大动物模型--链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导单肾切除大鼠，探讨CTGF在介导肾脏肥大形成中的可能作用及其作用机制。 方法：人近端肾小管上皮细胞株（human proximal tubular cell line，HPTCL）HK-2用含10％胎牛血清（fetal calf serum，FCS）的低糖型Dulbeccos’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）培养液培养。无血清培养24小时后，用AngⅡ(10-7mol·L-1)干预细胞，采用RT-PCR和Western blot技术观察0-72h CTGF mRNA和蛋白质表达时间效应关系；观察不同浓度AngⅡ(0-10-5mol·L-1)作用细胞48h后，HK-2 南京医科大学博士学位论文细胞CTGF mRNA和蛋白质表达的浓度效应关系。用抗CTGF抗体干预Angll（10一7mol·L一’）处理的细胞，分另!」观察其对细胞蛋白质从头合成（!’H卜leucine掺入实验）、细胞内总蛋白含量（考马斯亮蓝蛋白定量技术）、细胞大小（扫描电镜技术）的影响;抗CTGF抗体对Ang川10一7mol·L一’)诱导的细胞周期分布的影响（流式细胞分析技术）;运用RT-PCR技术和细胞免疫化学技术检测抗CTGF杭体对Angll诱导的细胞p27kip 1 mRNA及蛋白表达的影响，以及抗CTGF抗体对Fibroneetin（FN）mRNA表达的影响。我们还采用CTGF一反义寡核普酸（CTGF一AS）干预分另!J观察了其对HKZ细胞蛋白合成、细胞周期、细胞超微结构及形态改变、细胞表达a平滑肌肌动蛋白（a一smooth muscle aetin，。一SMA）改变的影响。在体实验中，我们采用一次性腹腔注射STZ建立单肾切除的SD大鼠糖尿病肾脏肥大模型。实验分三组，即:对照组（Control，GroupC）;糖尿病肾病组（diabetic nephropathy，DN，Group DN）:糖尿病肾病并采用血管紧张素11受体l桔抗剂一厄贝沙坦（i rbesartan，Irb）干预组（Group DNx）。实验动物分另，J在模型建立后第1、2、4、8周处死，取血、尿、’肾组织标本检查，观察血糖、’肾功能、尿蛋白定量（24h uPro）、尿白蛋白排泄（24hualb）改变。形态学检测包括肾脏重量、’肾重指数（KW/BW）、计算机辅助图象分析肾小球毛细血管拌面积（AG）、肾小球体积（VG）、’牙小管面积（AT）、以及电镜观察肾小球毛细血管基底膜、肾刁、管上皮细胞基底膜厚度改变等。免疫组化观察肾脏cTGF、P27kiPI、。一sMA表达的动态变化，南京医科大学博士学位论文并做CTGF表达与p27kipl、。一sMA表达、AG、VG、AT等指标的相关分析等。结果:Angll呈浓度和时间依赖性刺激cTGF mRNA和蛋白的表达，用Angl一（一。一7mol·L一‘）作用细胞。一72h，1 Zh时eTGFm洲A表达即显著增高（尸<0.01），24h蛋白表达明显增高;不同浓度的Angll （o一10一smol·L一，）作用细胞4sh，在10一gmol·L一’时eTGF mRNA表达增高，10一smol·L一，时蛋白表达最明显。用10一7mol·L一’Angll作用于细胞48h，细胞「3H]一leucine掺入量、细胞内总蛋白含量、细胞平均直径明显增加，这些作用可被抗CTGF抗体显著抑制;流式细胞分析技术显示用10一7mol·L一’Angll未}j激细胞48小时，细胞大部分阻滞在GO一GI期，抗CTGF抗体可以显著抑制细胞周期阻滞现象。Angll呈浓度和时间依赖性刺激p27kiPI和FN mRNA表达，p27kip 1 mRNA的表达48h达高峰，fN;nRNA表达贝，J持续升高，杭CTGF抗体可以显著才印制Angll诱导的HKZ细胞p27kipl、FN表达。采用cTGF一As干预Angll诱导的HKZ细胞上述效应，结果表明，CTGF一AS可以显著抑制AngH诱导的HKZ细胞CTGF mRNA和蛋白表达（尸分别<0.01）; CTGF一As还可以显著抑制Angll诱导的HKZ细胞总蛋白含量的增加（尸分另.J<0.05，0.01），且呈浓度和时间依赖性。对细胞周期分析显示，cTGF一As能显著抑制Angll所致的细胞周期阻滞在Go一Gl期。采用相差显微镜及扫描电镜观察显示，Angll导致细胞体积显著增大、变形，而CTGF一AS可以显著抑制细胞的 南京医科大学博士学位论文这种形态改变。透射电镜观察显示，Angll诱导细胞肥大，细胞表面微绒毛减少，细胞内粗面内质网增多、线粒体减少、高尔基器增加等，而CTGF一AS干预组可见细胞体积减小，细胞内线粒体增多、内质网减少等。我们进一步观察Angll对HKZ细胞a一SMA表达的影响，发现随着Angll作用时间的延长，?