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研究目的脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy, SAE)是脓毒症患者常见的神经系统功能障碍,症状轻可谵妄,严重者昏迷,与脓毒症患者死亡率密切相关。SAE引起的远期认知功能改变是主要的神经损伤之一,且与脓毒症症状的严重程度并无相关性,对患者远期的生活质量影响较大。既往研究中指出,海马的炎性损伤是造成远期认知功能障碍的可能机制之一,其中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的促炎作用十分重要,因此,针对IL-1β生成的干预措施可能对SAE治疗和预后有益。白藜芦醇(resveratrol, Res)是一种天然的Sirtl激动剂,其自身也具有多种生物活性。在脓毒症的动物模型相关文献已经报道了白藜芦醇可提高脓毒症动物模型的生存率,对脓毒症引起的肾、肺等其他脏器功能衰竭具有治疗和保护作用,机制可能与减轻IL-1p造成的炎性损伤相关。本研究拟通过经典盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)法复制脓毒症小鼠模型,研究白藜芦醇对SAE小鼠海马炎性损伤的保护作用,并通过在体模型和体外BV2细胞培养初步探讨白藜芦醇对SAE小鼠海马炎性损伤保护作用的机制。研究方法1、白藜芦醇对SAE小鼠海马炎性损伤的保护作用(1)将野生型C57BL/6小鼠随机分为CLP组、假手术组(Sham组)、高剂量白藜芦醇组(Resl组)和低剂量白藜芦醇组(Res2),白藜芦醇组分别于术前1h、术后6h、术后12h和术后18h腹腔内注射不同剂量白藜芦醇,CLP组和Sham组于相同时间点腹腔内注射二甲基亚砜(dimethy sulfoxide, DMSO)。术后第4天开始,连续四天行隐蔽站台实验；第7天行空间探索实验。记录各组水迷宫实验(Morris Water Mazing, MWM)结果并统计分析相关指标。(2)将野生型C57BL/6小鼠随机分为CLP组、假手术组(Sham组)、高剂量白藜芦醇组(Resl组)和低剂量白藜芦醇组(Res2),白藜芦醇组分别于术前1 h、术后6h、术后12h和术后18h腹腔内注射不同剂量白藜芦醇,CLP组和sham组于相同时间点腹腔内注射DMSO。术后24 h观察并比较不同组小鼠海马细胞凋亡情况和免疫组织化学染色特点,利用免疫荧光双染色定位白藜芦醇的潜在作用靶点。2、白藜芦醇对SAE小鼠海马炎性损伤保护作用的机制(1)将野生型C57BL/6小鼠随机分为CLP组、假手术组(Sham组)、高剂量白藜芦醇组(Resl组)和低剂量白藜芦醇组(Res2组),每组6只,白藜芦醇组腹腔内注射不同剂量白藜芦醇,CLP组和Sham组于相同时间点腹腔内注射DMSO。术后24 h比较不同组小鼠海马相关检测指标mRNA表达和蛋白表达水平。(2)利用BV2细胞建立小胶质细胞刺激模型,分为对照组(Con组)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激组(LPS组)、高浓度白藜芦醇处理组(Res3组)和低浓度白藜芦醇处理组(Res4组),培养24 h后比较不同组BV2细胞相关检测指标mRNA表达和蛋白表达水平。(3)利用BV2细胞建立小胶质细胞刺激模型,分为对照组(Con组)、LPS刺激组(LPS组)、白藜芦醇处理(Res3组)和尼克酰胺(nicotinamide, NAM)处理组(NAM组),培养24 h后比较不同组BV2细胞相关检测指标蛋白表达水平。结查1、隐蔽站台实验中,与Sham组(45.26±16.24)相比,CLP组(58.70±5.58)小鼠从训练第2天开始潜伏期延长(P<0.05)；第4天实验中,Res1组(29.77±13.13)与Res2组(44.77±17.99)潜伏期都较CLP组(57.29±8.15)缩短(P均小于0.05),与Sham组(27.28±13.19)相比,Res2组潜伏期长于Sham组(P<0.05),而Res1组则无显著差异。空间探索实验,与Sham组(2.67±0.82)相比,CLP组(0.17±0.41)和Res2组(2.17＋0.75)穿台率较低(P均小于0.01),目标象限时间短(Sham组vsCLP组,Res2组：41.89±7.53 vs 6.47±4.63,23.17±4.96,P均小于0.01),而Res1组穿台率(1.00±0.63)高于CLP组和Res2组,目标象限时间长(16.35±6.19,P均小于0.01)。2、CLP组小鼠海马细胞凋亡数目(17.00±1.00)显著多于Sham组(1.67±0.58)和Resl组(4.00±1.00,P均小于0.01),Res1组和Res2组(9.67±0.58)小鼠海马细胞凋亡数目也具有显著差异(P<0.01)。与Sham组相比,CLP组(CLP组vs Sham组：1.33±0.58 vs 15.33±0.58)小鼠IL-1β含量升高,小胶质细胞激活(Sham组vs CLP组：1.00±0.00 vs 16.33±1.53)增多,结果具有显著差异(P均小于0.01),白藜芦醇可减少IL-1β的数量和小胶质细胞激活(P均小于0.01)。免疫双荧光染色显示IL-1β生成(Sham组vs CLP组：1 464.99±196.25 vs 6 056.27±239.73)与小胶质细胞激活(Sham组vs CLP组：1 180.10±167.76 vs 5810.60±337.42)相关,Resl组二者荧光强度为2048.41±104.60和1770.88±90.53,Res2组二者荧光强度为4405.97±207.80和3132.35±178.51,与CLP组有差异。(P均小于0.01)3、在体模型实验中,Res1组与Res2组小鼠Sirtl mRNA (Res1组vs Res2组：11.58±3.45 vs 5.62±1.17)含量较Sham组和CLP组(Sham组vs CLP组：1.00±0.00 vs3.37±0.24)小鼠显著增加(P均小于0.05)；与CLP组小鼠相比,Resl组和Res2组小鼠IL-1β及NALP3的mRNA含量(Resl组,Res2组vs CLP组：2.15±0.93,4.29±1.14vs 9.46±1.35,1.57±0.22,2.77±0.60 vs 6.26±2.42)和蛋白含量(Resl组,Res2组vs CLP组：1.96±0.07,2.94±0.09 vs 4.02±0.05; 1.32±0.05,2.10±0.10 vs 2.84±0.07)都显著减少(P均小于0.05),Ibal蛋白(Resl组,Res2组 vs CLP组：1.65±0.10,2.32±0.26 vs3.72±0.04)含量亦明显减少(P均小于0.05),两组相比,Resl组变化较Res2组更显著(P均小于0.05)。4、体外BV2细胞实验中,Res3组与Res4组SIRT1 mRNA水平(Res3组vs Res4组：6.43±0.95 vs 3.58±0.51)较Con组和LPS组显著升高(Con组vsLPS组：1.00±0.00vs 1.69±0.17,P均小于0.01),LPS组NALP3和IL-1β mRNA水平分别是：16.25±4.30和10.64±2.29,Res3组二者mRNA水平分别是1.68±0.29和1.76±0.30,Res4组为6.67±0.65和5.31±1.91,与LPS组相比表达水平都显著降低(P均小于0.01)；Res3组和Res4组NALP3的蛋白表达水平分别为1.13±0.05和2.06±0.09,与LPS组3.08±0.09相比显著降低(P均小于0.01),半胱天冬酶-1(caspase-1) (Res3组,Res4组vs LPS组：1.92±0.14,2.59±0.15 vs 3.76±0.24)和IL-1β蛋白(Res3组,Res4组vsLPS组：2.43±0.31,3.79±0.04 vs 1.05±0.07)表达水平降低(P均小于0.01),影响与浓度相关(P<0.05)。5、体外BV2细胞实验中,NAM组NALP3 (2.23±0.10)、caspase-1 (2.23±0.10)和IL-1β (4.16±0.05)蛋白表达水平较Res3组(1.18±0.03；2.20±0.13；2.12±0.08)升高(P均小于0.01)。结论白藜芦醇可减轻SAE小鼠海马的细胞凋亡和炎性损伤,改善脓毒症小鼠认知功能,其机制可能与激活Sirtl后抑制海马小胶质细胞NALP3的表达,从而降低IL-1β炎性损伤有关。