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血小板P2Y12拮抗剂是急性冠脉综合征、缺血性脑卒中等心脑血管疾病患者临床治疗策略的重要组成部分。然而,部分患者在服用P2Y12拮抗剂后,心肌梗死、支架内血栓等复发缺血性事件仍有发生,这与药物抵抗导致的治疗后血小板高反应性有关,其中以氯吡格雷抵抗现象最为普遍。如何改善药物抵抗,降低缺血性事件的复发风险,是目前心脑血管研究领域的难点和热点。传统活血化瘀中药具有多靶点、多途径协同作用的优势,可广泛应用于心脑血管疾病的防治。近年来,有关活血化瘀中药对P2Y12受体拮抗剂药物抵抗干预作用的临床研究主要集中于对氯吡格雷抵抗的改善作用,但其临床疗效、安全性目前尚无相关系统评价。川芎嗪是活血化瘀中药川芎的有效成分之一,既往研究表明,川芎嗪可通过调节血栓素A2-前列环素系统、降低血小板内的钙离子浓度、影响磷脂酰肌醇代谢等途径发挥抗血小板活化的作用。P2Y12受体及相关信号通路不仅是影响药物反应性的重要通路,同时也是干预药物抵抗的可能作用靶点。前期研究表明,P2Y12受体相关通路是活血化瘀中药抗血小板活化和预防血栓形成的可能靶点之一。作为具有确切临床疗效的活血化瘀中药成分川芎嗪,是否通过调控P2Y12受体及其相关信号通路、改善药物抵抗而发挥抗血小板活化的作用,目前尚不明确。基于此,本课题组开展如下研究:(1)活血化瘀中药改善氯吡格雷抵抗的Meta分析;(2)川芎嗪抗血小板活化的作用研究;(3)基于研究2的结果和P2Y12受体相关信号通路,探讨川芎嗪抗血小板活化的作用机制。研究一活血化瘀中药改善氯吡格雷抵抗的Meta分析目的:系统评价活血化瘀中药改善氯吡格雷抵抗的有效性和安全性方法:检索数据库 CNKI、WFDP、VIP、CBM、Pubmed、EMBASE、Cochrane中活血化瘀中药改善氯吡格雷抵抗的随机对照试验。检索时间为建库至2019年11 月。英文检索词包括“clopidogrel resistance”“low response to clopidogrel,“clopidogrel”“high residual platelet reactivity”“Traditional Chinese Medicine”“activating blood circulation”,中文检索词包括“氯吡格雷抵抗”“氯吡格雷低反应”“氯吡格雷”“高血小板反应性”“中药”“活血”。应用Cochrane系统评价员手册提供的标准进行质量评价,应用Revman5.3软件对所提取的数据进行统计处理,系统评价活血化瘀中药改善氯吡格雷抵抗的有效性和安全性,以期为临床用药提供参考。结果:共筛选文献977篇,根据纳排标准,最终纳入6篇中文文献进行Meta分析,共602例氯吡格雷抵抗受试者。试验组干预措施为活血化瘀中药联合常规西药治疗(含氯吡格雷),对照组干预措施为常规西药治疗(含氯吡格雷)。Meta分析结果显示,治疗后,在升高ADP诱导的血小板聚集抑制率方面,试验组疗效优于对照组[MD=6.08,95%CI(3.63,8.53),P<0.00001];在降低心脑血管不良事件发生率方面,试验组疗效优于对照组[RR=0.48,95%CI(0.34,0.69),P<0.0001]。结论:活血化瘀中药联合常规西药治疗氯吡格雷抵抗患者,在升高血小板聚集抑制率、降低心脑血管不良事件发生率等方面优于单纯常规西药治疗。研究二川芎嗪抗血小板活化的作用研究目的:观察川芎嗪干预对P2Y12受体介导的血小板活化的影响方法:制备血小板悬液,先用MRS2179抑制P2Y1受体,再给予诱导剂刺激以建立P2Y12受体介导的血小板活化模型。分别设立resting组、control组、模型组、阳性对照组、川芎嗪3个剂量组(1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L)。采用光比浊法检测川芎嗪干预后的血小板聚集率;采用乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测川芎嗪对血小板膜完整性的影响;采用流式细胞术检测血小板表面受体CD62p、PAC-1的表达;通过凝块收缩实验观察川芎嗪对血小板凝块收缩面积的影响。结果:川芎嗪在(1-3mmol/L)不破坏血小板膜完整性,对血小板无毒性。与resting组比较,control组血小板聚集率以及CD62p、PAC-1受体表达水平明显升高(P<0.001)。与control组比较,模型组血小板聚集率降低(P<0.001),CD62p、PAC-1受体表达水平升高(P<0.05)。与模型组比较,川芎嗪(1-3mmol/L)可明显降低血小板聚集率(P<0.001),降低血小板CD62p、PAC-1受体表达水平(P<0.05);川芎嗪(2-3mmol/L)可明显减少血小板凝块收缩面积(P<0.05)。与阳性对照组比较,川芎嗪(3mmol/L)可降低血小板聚集率(P<0.001)、降低血小板CD62p、PAC-1受体表达水平以及减少血小板凝块收缩面积(P<0.05)。结论:川芎嗪可通过抑制P2Y12受体介导的血小板聚集、分泌及黏附功能,从而发挥抗血小板活化的作用。研究三川芎嗪抗血小板活化作用机制研究目的:探讨川芎嗪抑制P2Y12受体介导的血小板活化的作用机制。方法:制备血小板悬液,先用MRS2179抑制P2Y1受体,再给予诱导剂刺激以建立P2Y12受体介导的血小板活化模型。分别设立resting组、control组、模型组、阳性对照组(替格瑞洛)、川芎嗪组、AC抑制剂组(SQ22536)、川芎嗪+AC抑制剂组、PI3K抑制剂组(LY294002)、川芎嗪+PI3K抑制剂组。采用 Western-blot 法检测 p-VASPser157、Akt、p-Aktser473、p-AktThr308 蛋白表达;采用Elisa试剂盒检测血小板cAMP、血小板炎症因子IL-1β、sCD40L含量;采用光比浊法检测血小板聚集率;采用流式细胞术检测血小板CD62p、PAC-1受体表达。结果:与control组比较,模型组血小板聚集率降低(P<0.001);血小板CD62p、PAC-1受体以及血小板炎症因子IL-1β、sCD40L表达升高(P<0.05);血小板 cAMP、p-VASPser157蛋白表达降低(P<0.05),血小板 p-Aktser473、p-AktThr308蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组比较,川芎嗪组血小板聚集率(P<0.001),血小板CD62p、PAC-1受体以及血小板炎症因子IL-1β、sCD40L的表达均降低(P<0.05);血小板 cAMP、p-VASPser157蛋白表达升高,血小板 p-Aktser473、p-AktThr308蛋白表达降低(P<0.05)。加入SQ22536阻断AC/cAMP通路后,与川芎嗪组比较,川芎嗪+SQ22536组血小板聚集率(P<0.001),血小板CD62p、PAC-1受体以及血小板炎症因子IL-1β、sCD40L的表达水平均升高(P<0.05);血小板 cAMP、p-VASPser157 蛋白表达降低(P<0.05)。加入 LY294002 阻断 PI3K/Akt通路后,与川芎嗪组比较,川芎嗪+LY294002组血小板聚集率(P<0.001)、血小板CD62p、PAC-1受体表达水平以及血小板炎症因子IL-1β、sCD40L的表达水平均降低(P<0.05);血小板p-Aktser473、p-AktThr308蛋白表达降低(P<0.05)。结论:川芎嗪可抑制P2Y12受体介导的血小板活化,其机制可能与上调AC/cAMP信号通路、抑制p-Akt蛋白表达有关。