豆类丝核菌培养液中苦马豆素的初步分离

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目的:旨在寻求新的苦马豆素(swainsonine,SW)的来源,探索大批量获得SW 的途径,降低SW 抗肿瘤临床应用成本,实现SW 的药用价值。为人类和动物肿瘤病的治疗研究提供新药奠定物质基础。方法:1. 定期用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)移接豆类丝核菌,使之保持旺盛的生长力。2. 将SW 高产菌株用改良的Czapek’s 培养基进行培养,获得豆类丝核菌培养液。3. 用絮凝、沉淀、离心、吸附等法对培养液进行预处理。4. 五种不同的方法进行SW 的提取探索。①取500ml 预处理完备的10.2411 菌株培养液,用2mol/L 氨水调pH10,用正丁醇萃取三次,合并三次的正丁醇,用0.5mol/L 硫酸调pH7,反复振荡,静置,留水层,水层再用2mol/L 氨水调pH10,50℃蒸干,即得总生物碱,其中含SW粗品。②取500ml 预处理完备的10.2411 菌株培养液,50℃蒸成浸膏状,用乙醇索氏抽提24h,乙醇提取物减压浓缩,回收乙醇,残留物蒸干,用2mol/L氨水调pH10,挥干,用无水氨性氯仿提取5 次,滤除不溶物,滤液蒸干,90℃减压升华可得到SW 纯品。③取500ml 预处理完备的3.2871A菌株培养液,调pH10,用H2O∶CH2Cl2 (3∶1, v/v )萃取,弃去CH2Cl2 层,将水层调pH10 后,再用H2O∶CH2Cl2(3∶1, v/v )萃取,弃去CH2Cl2层,将水层调pH7,浓缩后上732 型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂,先用去离子水洗脱,后用1mol/LNH4OH 洗脱,收集氨洗液,调pH7,浓缩后冻干,得到浅黄色粉末,即SW 粗品。④取500ml 预处理完备的3.2888 菌株培养液,用2mol/L 盐酸调pH2 左右,加入新鲜配制的雷氏盐饱和水溶液,滤集生成的生物碱雷氏盐沉淀。将沉淀溶于丙酮,滤除不溶物,向丙酮液中加入硫酸银饱和水溶液,过滤后向滤液中加入计算量氯化钡溶液,过滤,滤液蒸干即得总生物碱盐酸盐,用2mol/L 氨水将总生物碱盐酸盐调pH10,挥干,得干粉3.467g上硅胶柱。用乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱,洗脱梯度依次为10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶4,每30ml~50ml 收集一瓶,共收集85 瓶。用紫外分析仪观察相同或相似的合并,浓缩后薄层层析(TLC)检测,并与SW 标准品对照,斑点和Rf 相同或相近的合并,冻干即得SW 粗品0.88g,90℃减压升华可得到SW 纯品。⑤取500ml 预处理完备的3.2888 菌株培养液,调pH7,上大孔吸附树脂,反复富集5次,静置12h,用滴水冲洗,洗2 个柱体积,收集水洗脱液,再用乙醇洗脱,收集约2个柱体积的醇水混合洗脱液,最后收集2 个柱体积的醇洗脱液,分别减压浓缩各洗脱段的液体,经TLC 检测生物碱主要存在于醇洗脱段,合并醇洗液,减压回收乙醇,余液冻干,可得到SW 粗品。结果:初步探索的方法获得了一定量SW 粗品。小结:SW 是一种水溶性极强的生物碱,而培养液又是水环境,这就给分离工作带来很大的困难,其中萃取、过柱的损失均很大,有待完善。
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