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卵巢卵泡选择是一个重要的生物学过程,与鸡的产蛋性能和繁殖力高度相关.卵泡选择主要依赖于来自垂体FSH的调控以及卵泡FSHR的表达.在规律产蛋的母鸡中,具有最高FSHR表达量的小黄卵泡将被选择进入等级卵泡,快速生长发育直至排卵.对鸡卵泡选择分子机制的研究,有助于鉴定鸡及其它家禽产蛋性状的关键基因,能够为有效的开发利用卵巢内的卵泡资源,提高鸡的产蛋和繁殖性能提供理论依据.为了揭示鸡卵泡选择的分子机制,本研究对FSHR表达量最高和最低的两组小黄卵泡进行了转录组测序,通过比较FSHR不同表达水平小黄卵泡的差异表达基因,探索与卵泡选择有关的基因,分析其在鸡卵泡选择中的功能并阐述其转录调控机制.结果如下: (1)鸡小黄卵泡的转录组测序.转录组测序共检测了六个小黄卵泡,其中T1、T2、T3为FSHR表达量低的卵泡,T4、T5、T6为FSHR表达量高的卵泡,共检测了17993个基因,T1/T4中获得1968个差异基因,561个上调基因,1407个下调基因;T2/T5中获得289个差异基因,104个上调基因,185个下调基因;T3/T6中获得590个差异基因,225个上调基因,365个下调基因,三组共有的差异基因为40个,能够注释到NCBI上的为35个.GO分析表明差异基因在细胞组分中的主要分类为细胞组分,细胞、细胞器、膜.分子功能主要分为结合和催化活性.生物学过程主要包括细胞过程、单一生物过程、生物学调节和代谢过程.差异基因参与多种生物学功能,如激素代谢过程、类固醇代谢过程、性腺发育、繁殖过程的调控、细胞增殖、蛋白磷酸化以及血管发生等,其中Wnt4参与大部分的生物过程.对检测到的DEGs进行KEGG通路富集分析,发现随着FSHR表达量差异的增大,显著富集到的KEGG通路的数量也逐渐增加,其中在T1/T4组,显著富集到了如TGF-βsignaling pathway、MAPK signaling pathway、Wnt signaling pathway等与卵泡发育密切相关的信号通路.对Wnt signaling pathway中显著富集到的多个DEGs的分析发现,Wnt4在FSHR表达量高的卵泡中高表达,显著高于FSHR表达量低的卵泡,差异倍数高达4.23.为了预测与卵泡选择相关的关键候选基因,从测序所得的差异基因中,筛选出来一批共有差异基因,进行了蛋白网络互作分析,成功构建了由122个基因与185对互作关系构成的蛋白互作网络,结果发现如Smad2、Wnt4和FSHR等基因在互作网络中处于重要的调控位置.进一步的网络模块分析揭示出3个节点为关键调控基因,依次为Gnao1,Smad2,Wnt4.并对关键差异基因进行了GO功能注释.从测序结果中挑选十个基因进行了qRT-PCR验证,表达趋势与测序结果基本一致.综合上面的分析结果,推测Wnt4可能在卵泡选择和发育过程中起着重要的调控作用,接下来对Wnt4的功能进行了系统的研究. (2)Wnt4在鸡卵泡中的表达特征.Wnt4属于Wnt家族的成员,是一种分泌型的糖蛋白.Wnt家族成员在哺乳动物卵泡发育中起到很重要的调控作用,但对于禽类卵泡发育的研究还相对较少.本研究首先对Wnt4在鸡卵泡发育过程中的表达进行了检测,发现Wnt4mRNA在等级前卵泡中的表达水平较高,显著高于等级卵泡,尤其在6-8mm小黄卵泡中的表达水平最高,其mRNA和蛋白表达在排卵前后都处于一个较低的水平.Wnt4在鸡卵泡颗粒细胞中的表达量显著高于膜细胞,主要在鸡等级前卵泡颗粒细胞中表达. (3)鸡Wnt4的功能及表达调控.Wnt4能够刺激卵泡颗粒细胞的增殖,上调卵泡中StAR和CYP11A1类固醇激素合成基因的表达,上调FSHR的表达并下调AMH和OCLN的表达,说明Wnt4在卵泡选择和发育过程中起到一定的调控作用.FSH能够显著上调鸡卵泡颗粒细胞中Wnt4mRNA和蛋白的表达.在卵泡选择前后,Wnt4对于FSH效应的影响有一定的不同,在等级卵泡颗粒细胞中,Wnt4能够增强FSH对于孕酮合成和类固醇激素生成相关基因表达的促进作用,但在鸡等级前卵泡颗粒细胞中,Wnt4却抑制FSH的促进作用. (4)IWR-1对FSHR、StAR和CYP11A1表达的影响.Wnt经典信号通路对于类固醇基因表达至关重要,IWR-1是经典Wnt信号通路的抑制剂,当Wnt经典信号通路被抑制后,StAR和CYP11A1表达量降低,同时FSH的促进作用也受到了抑制,这种抑制作用当过表达Wnt4后出现了缓解. (5)鸡Wnt4转录关键调控区的鉴定.Wnt4启动子区-3354至-2689为关键调控区域,能够响应FSH的刺激,其中-3015(G＞C)位点有可能是转录因子NFAT5的结合位点,通过响应FSH的应答调控Wnt4基因的转录. (6)其它参与Wnt信号通路基因在卵泡中的表达情况及作用分析.Axin2、Fzd1、WIF1以及Wnt9a均在6-8mm的小黄卵泡中表达量最高,显著高于其他等级卵泡;Wnt5a在F1中有较高水平的表达;CTNNB1的表达量在各等级卵泡中没有明显差异,在排卵后卵泡中出现显著的下降.Wnt5a能够显著上调FSHR的表达,WIF1则能显著下调FSHR的表达并上调StAR的表达. 综上所述,本文研究了FSHR不同表达水平的小黄卵泡中基因表达的变化,分析了卵泡选择过程中差异表达的基因,并对Wnt4在卵泡选择发育过程中的作用以及其它参与Wnt信号通路基因在卵泡中的表达情况及作用进行了深入的探讨.本研究可为提高鸡的产蛋性能提供理论依据,为进一步阐明哺乳动物卵泡选择的分子机制提供参考.