蓝舌病(Bluetongue)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的经媒介昆虫传播的一种反刍类动物急热性疾病。绵羊为本病的主要易感动物,牛、山羊和许多野生反刍动物也感染此病,但通常表现为亚临床症状或无临床症状。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为法定通报性疾病。该病是阻碍反刍动物国际贸易和生产的重大疫病,平均每年在全世界造成超过30亿美元的经济损失。BTV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员。BTV粒子呈二十面体对称,无囊膜,直径约为70～80nm。BTV的核酸由10个双股RNA(double-stranded RNA, dsRNA)节段组成,按长度大小依次命名为segmentl-segment10(Seg-l-Seg-10), BTV的10个双股RNA节段总长度在19.2Kb左右,分别编码7种结构蛋白(VP1-VP7)和5种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3a、NS4)。病毒的衣壳可以分为3层,其外层由两种结构蛋白组成,分别是VP2和VP5,其中VP2蛋白是型特异性蛋白,决定BTV的血清型；中间层由VP7蛋白构成；最内层的核心衣壳由VP3蛋白构成。病毒基因组和VP1、VP4、VP6三种酶活性结构蛋白被包裹在核心衣壳内部,另外五种非结构蛋白NS1、NS2、NS3、 NS3a、NS4在被病毒感染的细胞中合成。目前已从非洲、欧洲、亚洲、北美、南美和大洋洲的多个热带、亚热带和温带地区国家分离到BTV,并且其分布范围不断扩大,危害也日趋严重。BTV血清型众多,到目前为止,全世界共分离到26个血清型的BTV。我国自1979年在云南首次分离到BTV以来,到现在国内共分离到BTV-1、2、3、4、12、15、16共七个血清型的BTV。近年来,蓝舌病在欧洲许多国家相继暴发,且分布范围不断扩大,特别是2006年以来BTV-8和BTV-6在欧洲多个国家流行,对欧洲的牛羊养殖业造成了严重危害,也引起了高度重视。预防和控制蓝舌病已成为当前国际上重大动物传染病研究中的一个热点。虽然OIE将蓝舌病同禽流感等一些重要动物疫病共同列入法定通报性疾病,在国外也受到高度重视,但在国内受重视的程度还不够,投入的研究也较少。在我国虽然没有像欧洲地区那样,出现BTV强毒株的暴发,但是随着进出口贸易的日益频繁,完全存在国外的强毒株传播到国内的风险。同时,由于BTV为基因分节段的病毒,不同毒株间可以在自然界发生基因重组,所以也不能排除国内出现自然重组强毒株的可能性。因此,在加强对蓝舌病的重视程度的同时,十分有必要加强在BTV各个方面的研究工作。目前我国在蓝舌病研究领域虽然取得了一些成绩,但是在总体上仍大幅度落后于国际先进水平。在病毒的感染复制过程研究、致病机理研究,特别是新型标记疫苗研制方面一直没有突破性的进展,而缺少BTV反向遗传操作技术平台,正是制约我国深入开展蓝舌病研究的最主要原因。因此,要改变我国在蓝舌病研究领域的落后现状,就必需建立起我国自己的BTV反向遗传操作技术平台。本研究利用全长cDNA扩增法(full-length amplification of cDNAs, FLAC)对本实验室保存的一株血清1型BTV SZ97/1株进行了全基因序列测定。测序结果表明,该毒株10个节段基因从Seg-l-Seg-10核苷酸长度分别为3944bp、2940bp、2772bp、1981bp、1772bp、1635bp、1156bp、1125bp、1049bp和822bp。编码的7个结构蛋白(VP1-VP7)的氨基酸长度分别1302aa、961aa、901aa、644aa、526aa、329aa和349aa。编码的5个非结构蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3a、NS4)的氨基酸长度分别552aa、354aa、229aa、216aa、77aa。虽然各个节段基因的非编码区序列相互差异较大,而且长度也各不相同,但是每个节段非编码区两端的前6个核苷酸均相同,靠近5’端的前6个碱基序列GTTAAA,靠近3’端的前6个碱基序列为ACTTAC。在编码每个蛋白的基因终止密码子序列方面,编码VP1、VP2、VP5蛋白基因终止密码子为UGA,编码VP4、VP6、NS3、NS3a蛋白基因终止密码子为UAA,编码VP3、VP7、NS1、NS2、NS4蛋白基因终止密码子为UAG。本研究完成了我国血清1型BTV SZ97/1株的全基因组测序工作,这也是在我国首次获得血清1型BTV毒株的全基因序列,为进一步开展对国内外血清1型BTV的分子特征和地理起源分析的研究提供重要的参考数据。在获得了SZ97/1株BTV的全基因组序列的基础上,本研究使用pCI-neo真核表达载体,成功构建了表达SZ97/1株BTV的VP1、VP3、VP4、VP6、VP7、NS1和NS2蛋白的7个真核表达质粒：pCI-VP1、pCI-VP3、pCI-VP4、pCI-VP6、pCI-VP7、pCI-NS1和pCI-NS2。同时又构建了克隆有SZ97/1株BTV的全部10个基因节段(Seg-1-Seg-10)的10个体外转录质粒：pBbBa-S1、pBbBa-S2、pBbBm-S3、pBbBa-S4、pBbBa-S5、pBbBa-S6、 pBbBa-S7、pBbBa-S8、pBbBa-S9、pBbBa-mS10。其中在构建Seg-10节段的体外转录质粒pBbBa-mS10时,用定点突变的方法,在Seg-10节段中引入AflⅡ限制性内切酶酶切位点序列作为分子标签。在进行体外转录之前,分别使用限制性内切酶BsmB I或Bsa I先将环形的10个体外转录质粒进行酶切线性化处理,使用RNA体外转录试剂盒—RiboMaxTM Large Scale RNA Production Systems-T7，以酶切线性化的质粒DNA为模板,按照说明书步骤进行BTV各个基因节段RNA的体外转录,在反应结束后立即使用RNA纯化试剂盒对体外转录的RNA进行纯化,纯化后的RNA在-80℃保存。将已经构建的表达BTV的VP1、VP3、VP4、VP6、VP7、NS1、NS2蛋白的7个真核表达质粒：pCI-VP1、pCI-VP3、pCI-VP4、pCI-VP6、pCI-VP7、pCI-NS1和pCI-NS2共同转染12孔细胞培养板中的BHK-21细胞。在18小时后,再转染10个体外转录获得的RNA产物。在体外转录RNA转染细胞48小时后,转染的BHK-21细胞已经全部病变,收集转染细胞上清和沉淀,冻融一次,离心后收获上清在-80℃冻存,将拯救出的病毒命名为rBTV1。对拯救的病毒分别进行间接免疫荧光、电镜以及基因测序检测,结果表明本研究成功拯救出了带有分子标记的BTV。对拯救毒株rBTV1进行生长曲线的测定结果表明,拯救毒rBTVl与亲本毒SZ97/1具有基本一致的生长曲线,在接毒后60～72小时内可达到最高滴度1×108TCID50/mL。本研究首次在我国成功建立了BTV的反向遗传操作系统,为我国深入开展BTV致病机理、传播机制、基因组功能的研究以及新型疫苗的研发奠定了基础。