论文部分内容阅读
目的:本次实验通过组织贴壁法从人脐带组织中分离得到脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs),采用沉淀法分离出外泌体(exosomes)并鉴定,探索人脐带间充质干细胞来源外泌体(Human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes,hUC-MSCs-exo)的提取与鉴定方法,为以后研究奠定基础。再探究hUC-MSCs-exo对骨肉瘤Saos-2细胞生长的影响。方法:经医院伦理委员会批准于产房获取新鲜合格人脐带组织样本,采用组织贴壁法获得hUC-MSCs细胞,并对间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)进行培养、传代、冻存及复苏等操作。后采用沉淀法分离出hUC-MSCs-exo,流式细胞术对外泌体表面标记蛋白CD63、CD81进行检测。再探讨hUC-MSCs-exo混悬液对骨肉瘤Saos-2细胞的作用。对Saos-2细胞用DAPI荧光核染色,外泌体进行PKH26荧光标记。将标记好的hUC-MSCs-exo液加入骨肉瘤Saos-2细胞培养液中培养24 h,荧光显微镜观察外泌体能否被骨肉瘤Saos-2细胞摄取。收集并配制不同浓度hUC-MSCs-exo混悬液,将实验分组:(1)外泌体组:分为滴加200、400、800μg/ml外泌体混悬液作用于骨肉瘤Saos-2细胞;(2)自噬抑制组:滴加200μg/ml外泌体悬液时,加入自噬抑制剂3-MA;(3)Control组:滴加相同体积的无血清培养基,余条件同上。使用细胞计数法、CCK-8实验、Transwell检测作用后的骨肉瘤Saos-2细胞增殖、迁移及侵袭能力,MDC细胞自噬染色试剂盒检测Saos-2自噬水平变化,Western blot检测自噬标志蛋白Beclin1表达量。结果:组织块贴壁法成功分离出hUC-MSCs细胞,采用沉淀法成功分离hUC-MSCs上清液沉淀。使用流式细胞术鉴定上清沉淀,结果示本次提取的上清沉淀富集CD81及CD63蛋白,表示所提取的上清沉淀的hUC-MSCs-exo浓度较高。PKH26标记的外泌体与肿瘤细胞共培养24 h后,荧光显微镜观察证实Saos-2细胞对外泌体有摄取作用。细胞计数法和CCK-8实验表明MSCs-exo组与对照组相比可促进骨肉瘤Saos-2细胞增殖,并且Saos-2细胞增殖能力随着外泌体混悬液浓度增高而增强,然而exo+3-MA组细胞数目及OD值明显低于外泌体组。Transwell实验检测每组骨肉瘤细胞迁移及侵袭情况。镜下观察到外泌体组穿膜细胞量明显多于对照组,且随着外泌体浓度的升高骨肉瘤细胞迁移及侵袭能力明显增强。而exo+3-MA组,Sao-2细胞迁移及侵袭能力较外泌体组明显下降。使用MDC染色法再次检验自噬情况,发现经外泌体处理后荧光斑点数量随浓度明显增加。Western blot检测示随着MSCs-exo的浓度升高,Beclin1蛋白的灰度值明显上升。结论:(1)本实验通过采用组织块贴壁培养方法获取hUC-MSCs,沉淀法分离MSCs-exo,以及对提取物的鉴定,表明我们团队成功掌握了能够提取出合适浓度外泌体的方法。(2)hUC-MSCs-exo通过激活自噬作用于骨肉瘤Saos-2细胞,对该种细胞的生长及侵袭具有促进作用,并且作用能力随着外泌体液浓度增加而增强。