低温冻害是一种常见的环境胁迫因子,也是许多农作物区域性和季节性的限定因素,因此提高植物的抗寒性,一直是科学工作者的理想与追求,抗寒基因的分离、鉴定、克隆及转化一直是国内外科学家研究的热点之一,目前随着植物寒害机理、抗寒冻和冷驯化分子机理的深入发展,已研究发现了多种抗寒基因,包括各种抗寒调控基因和各种抗寒功能基因。常规育种方法很难提高作物的抗冻性,从而促使了植物抗寒冻基因工程的研究得到了广泛开展,国内外抗寒冻基因工程取得了很大成就。从拟南芥分离的基因Kin1编码6.5 kD的多肽,其氨基酸构成特别,富含丙氨酸,氨基乙酸,赖氨酸,Northern杂交分析显示在低温诱导下其mRNA水平增加了20倍。Kin1不仅受低温诱导,而且受ABA和水胁迫诱导,是植物在渗透胁迫和寒冷胁迫下常见的调节因子。序列比较分析和鱼类抗冻蛋白(AFPs)类似,其基因产物能够提高植物的抗冻性。本研究以拟南芥基因组RNA为模板,以RT-PCR的方法克隆了拟南芥afp,构建了其植物表达载体,为后续实验转化柑桔等提高其抗寒性奠定了实验基础。四季桔(C.microcarpa)是一种重要的观赏果树树种,由于北方比较寒冷,只能见到极少数量的室内盆栽四季桔,培育耐寒的四季桔,无疑具有重要的经济效益和生态价值。遗传转化技术的发展为柑桔育种提供了一条全新的途径,而建立适于基因转化的高效再生体系是进行遗传转化的前提和基础,柑橘组织培养已有30多年的历史,再生系统较为成熟,但适于遗传转化的高效再生体转化系并不完善。因此,近年来,高效再生转化体系的研究越来越得到重视。为使四季桔通过转抗寒功能基因的方法培育抗寒新品种,本文以四季桔上胚轴、子叶、叶、茎段为对象,进行再生体系建立的研究,以期为四季桔的遗传转化育种打下基础。主要研究结果如下:(1)以RT-PCR的方法从低温处理的拟南芥总RNA中克隆抗冻基因Kin1的cDNA,以pMD18-T Vector为载体构建其克隆载体pKT。PKT和中间载体SK用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切后回收的目的片段和载体片段相连接,构建中间载体KS-Kin。KS-Kin和载体PRT101用KpnⅠ和BamHⅠ双酶切后分别回收的目的片段和载体片段相连,构建另一中间载体PRT101-Kin,