【摘 要】
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聚酮化合物是由聚酮合酶(polyketide synthases,PKSs)催化合成的一大类次级代谢产物,具有多个手性中心是其显著的结构特征。在聚酮链延伸过程中,酮基还原酶(ketoreductases,K
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聚酮化合物是由聚酮合酶(polyketide synthases,PKSs)催化合成的一大类次级代谢产物,具有多个手性中心是其显著的结构特征。在聚酮链延伸过程中,酮基还原酶(ketoreductases,KRs)结构域同时控制C2位甲基和C3位羟基取代基的立体构型。A型KRs催化生成L-型羟基,B型KRs催化生成D-型羟基。A型KRs中的保守色氨酸残基和B型KRs中的保守LDD模体分别位于催化酪氨酸的两侧。本研究克隆表达了两性霉素(amphotericin)PKS第2模块中的A型KR结构域(AmpKR2),并获得AmpKR2与辅因子NADP~+和底物类似物2-甲基-3-酮戊酰泛酰巯基乙胺(2-methyl-3-oxopentanoyl-pantetheine,MOPP)三元复合物的晶体结构。该结构显示A型KRs中的保守色氨酸与底物中的泛酰巯基乙胺臂形成氢键,帮助MOPP从A型KR底物结合孔道远离辅因子的一侧进入活性中心,从而将C3酮基的re侧呈现给辅因子的4’-pro-S氢生成L-型羟基。AmpKR2在还原C3位酮基过程中保留C2位D-型甲基的构型,属于A1型KRs。但某些A型KR可以将D-型甲基异构化为L-型,被称为A2型KRs,其活性中心有一个保守的组氨酸残基。AmpKR2G355T/Q364H在还原2-甲基-3-酮戊酰乙酰半胱胺(2-methyl-3-oxopentanoyl-N-acetyl cysteamine,MOPN)时呈A2表型。本研究获得了AmpKR2 G355T/Q364H、NADP~+以及MOPP三元复合物的晶体结构。与野生型AmpKR2结构相比,突变体蛋白结合底物2-甲基-3-酮戊酰基团的口袋略大。酶动力学分析显示AmpKR2催化还原MOPP的K_m值明显小于催化还原MOPN的K_m值,与晶体结构中只能观察到MOPP而不能观察到MOPN的现象一致。AmpKR2还原MOPP只生成预期中的A1型(2D,3L)产物,但AmpKR2 G355T/Q364H还原MOPP同时生成了A1型产物(~57%)和A2型(2L,3L)产物(~43%),表明泛酰巯基乙胺臂对酶的立体特异性有明显影响。这些研究结果拓展了我们对PKS模块中KR结构域立体特异性的认识,为KR的设计改造提供了基础。
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