一、研究目的1、掌握小鼠肌源性干细胞(MDSC)悬浮培养相关细胞技术,建立MDSC悬浮培养模型,为进行局部密度差异悬浮培养奠定基础。2、在悬浮培养肌源性干细胞(MDSC)的基础上初步探讨集簇与分散培养(局部密度差异)对MDSC增殖活性的影响,以筛选更利于MDSC增殖的培养方式。3、以悬浮集簇培养为基础,模拟体内MDSC自我更新与增殖环境,探索以成纤维细胞和卫星细胞作为滋养细胞对MDSC增殖的作用,初步探讨悬浮共培养对MDSC增殖的影响机制。4、在已建立的与卫星细胞直接接触悬浮共培养模式的基础上,对比单纯悬浮培养法和最常用的传统差速贴壁培养法,观察不同培养方法得到MDSC细胞量差异及对MDSC的影响,验证悬浮共培养模式的优势。二、研究方法1、实验用2周龄C57BL/6小鼠40只,通过机械分离采取四肢骨骼肌、多步酶消化法制备细胞悬液,采用悬浮培养的方式培养细胞并进行细胞计数,用流式细胞术检测细胞表面干性因子,诱导分化验证其干性。2、实验用2周龄C57BL/6小鼠20只,通过机械分离采取四肢骨骼肌、多步酶消化法制备细胞悬液进行悬浮培养获取MDSC,在培养过程中分别吹打与静置。光镜观察与细胞计数统计比较增殖数量。流式细胞检测与分化实验验证细胞干性。3、实验用2周龄C57BL/6小鼠20只,通过机械分离采取四肢骨骼肌、多步酶消化法制备细胞悬液进行悬浮培养获取MDSC,分为与成纤维细胞共培养AB组和与卫星细胞共培养CD组,A、C组为条件培养基共培养组,B、D组为直接接触共培养组,各组分别设立对照。培养42天,光镜观察与细胞计数统计增殖数量。流式细胞检测与分化实验验证细胞干性。4、实验用2周龄C57BL/6小鼠18只,通过机械分离采取四肢骨骼肌、多步酶消化法制备细胞悬液进行悬浮培养获取MDSC,分为与卫星细胞直接接触共培养E组、悬浮培养F组和差速贴壁G组。培养21天,光镜观察与细胞计数统计增殖数量。流式细胞检测与分化实验验证细胞干性。三、研究结果1、光镜下见悬浮培养的细胞生长状况良好,细胞呈小球形,表面光滑,折光率高,逐渐形成小细胞团。计数显示细胞数量逐渐增多。流式分析可见细胞干性标记物(CD34、Sca-1)表达量随培养时间延长逐渐增高。培养细胞经成骨与成神经诱导后可分化,茜素红染色与p75NGF受体免疫荧光鉴定为阳性。2、集簇培养组MDSC呈团簇状,呈小球形,折光率高;分散培养组细胞呈单个或小团簇状,小球形,高折光,偶见细胞皱缩。计数结果显示集簇培养组MDSC增殖量为分散培养组1.5倍(P<0.05)。流式检测发现集簇培养组CD34+占45.77%、Sca-1+占 27.98%,双阳性占 18.90%,Pax7+占 23.4%;分散培养组 CD34+占 10.17%、Sca-1+占19.15%,双阳性占5.52%,Pax7+占8.88%。两组细胞经成骨与成神经诱导后可分化,茜素红染色与p75 NGF受体免疫荧光鉴定为阳性。3、A、C、D组细胞量均随培养时间延长而增加,B组初始增加后迅速下降消失,D组细胞量增加最大,实验组均较对照组细胞增殖量大(P<0.05),悬浮细胞均保持团簇状,呈小球形,折光率高。A、B组MDSC易贴壁,分化成高亮、粗大的肌纤维。C、D组可见少量细胞贴壁,未见明显细胞融合与分化。流式检测发现各组培养细胞CD34、Sca-1、Pax7表达量略有差异,差异无统计学意义。6组细胞经成骨与成神经诱导后可分化,茜素红染色与p75 NGF受体免疫荧光鉴定为阳性。4、三组细胞量均随培养时间延长而增加,E组增殖量最大,差异有统计学意义;F组在1周内高于G组,之后均低于其余两组。细胞均保持团簇状,呈小球形,折光率高。未见明显细胞融合与分化。流式检测发现各组培养细胞CD34、Sca-1、Pax7表达量略有差异,但差异无统计学意义。3组细胞经成骨与成神经诱导后可分化,茜素红染色与p75 NGF受体免疫荧光鉴定为阳性。四、结论1、悬浮培养的方法可以成功培养获得小鼠肌源性干细胞,该细胞表达干性因子标记物(CD34、Sca-1),并具有向中、外胚层分化潜能。2、悬浮集簇培养较分散培养获得细胞量更多,细胞干性因子(CD34、Sca-1)表达量更高,集簇培养方式较易促进MDSC向下游卫星细胞分化,两种培养方法获取MDSC均可向中、外胚层分化。3、与卫星细胞直接接触共培养所得MDSC细胞量更多,与成纤维细胞共培养易致MDSC终末分化或死亡,共培养所得MDSC均可表达干性因子CD34与Sca-1并向中、外胚层分化,培养时间较长可引起MDSC向下游卫星细胞分化。4、与卫星细胞悬浮共培养较传统差速贴壁法、单纯悬浮培养法获得MDSC细胞量多,所得MDSC均可表达干性因子CD34与Sca-1并向中、外胚层分化,MDSC向下游卫星细胞分化与培养时间延长有关,与培养方式关联有限。