对有机生物而言,绝大多数药物属于生物异源物质,一旦药物进入机体,就要被机体代谢。葡萄糖醛酸结合反应是其中一种普遍的Ⅱ相代谢反应,在此反应中药物在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）的催化下,与内源性的葡萄糖醛酸相结合,亲水性增加,更利于排出体外。过去几十年中,人们发展和使用了很多体外的实验方法来预测药物的动力学和代谢。近些年来国际上开始广泛使用的体外重组UGTs酶模型是对传统的微粒体孵育和动物实验的有效补充。它采用DNA重组技术,将人UGTs序列导入异源表达系统,建立UGTs转基因细胞系,来获得单一的重组UGT酶。这对于研究单一同工酶的活性,有针对性地进行其代谢功能和过程研究,了解药物相互作用机制,预测可能的药物相互作用是有效方式。到目前为止,很多人类UGTs蛋白都已在体外获得了异源表达,其它种属UGTs的体外表达也时有报道。但国内在此方面的研究起步较晚。在本文中,我们尝试中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL）和Bac-to-Bac^?杆状病毒感染的昆虫表达系统,获得了活性重组UGT1A3和UGT1A9蛋白,并以此为模型,对重要的UGTs O-葡萄糖醛酸结合底物-黄酮类-展开了一系列代谢研究。一.采用CHL系统和Bac-to-Bac_?系统表达活性人UGT1A3及UGT1A9UGTs超基因家族,根据氨基酸序列的同源性,可分为4个亚族:UGT1,UGT2,UGT3和UGT8。在这些同工酶中,UGT1和UGT2亚族,尤其是前者,与外源物代谢的关系最为紧密。人类UGT1A基因位于染色体2q37处,至少由13种不同的第一外显子和4个共同的外显子2-5组成。本文的研究模型UGT1A3和UGT1A9分别是UGT1A亚族中的第三号和第九号活性蛋白。我们先后尝试了CHL和Bac-to-Bac_?表达系统,以获得满足后续实验要求的活性UGT1A3和UGT1A9蛋白。1.活性UGT1A3在CHL细胞中的异源表达本实验以病人病灶组织旁的正常肝或胃组织的总RNA为模版,使用逆转录-聚合酶链扩增反应（RT-PCR）获得UGT1A3*2a基因。该基因与野生型UGT1A3*1基因相比具有3个单核苷酸突变,分别为(T31C,W¹¹R;G81A,E²⁷E和T140C,V⁴⁷A)。这其中2个是有义突变(T31C,W¹¹R和T140C,V⁴⁷A),1个是静默突变(G81A,E²⁷E)。经酶切和测序鉴定后,UGT1A3*2a被亚克隆入哺乳动物表达载体pcDNA3.1（+）,通过改良的磷酸钙转染法转入CHL中进行稳定表达。由于pcDNA3.1（+）载体带有G418抗性基因,我们采用400μg/ml的G418进行筛选,直至未转染组细胞完全死亡。筛选过后,我们以有限稀释法获得有抗性的单克隆,并用RT-PCR的方法确证了人UGT1A3*2a基因在单克隆中的表达。将转基因细胞超声破碎,包含有重组蛋白的细胞破碎液被用于进一步的孵育实验以测定重组酶的活性。以槲皮素为底物,在含有尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）的葡萄糖醛酸体外孵育系统中,重组UGT1A3.2酶代谢槲皮素产生1个槲皮素葡萄糖醛酸苷。该代谢物在孵育液的HPLC分析中被检测到,其二极管阵列光谱（DAD）与底物槲皮素十分相似,且经β-葡萄糖醛酸酶水解后消失,表明重组人UGT1A3*2a在CHL表达系统中获得了异源活性表达。各阴性对照组中没有产生该代谢物,表明CHL细胞内源性蛋白以及体外孵育系统不会对实验的专属性造成干扰。CHL重组细胞的蛋白平均浓度为4.3±1.2 mg/ml,酶活性在超过10 min后很快下降,且该重组酶催化的葡萄糖醛酸结合反应速率偏小,在本实验的检测条件下难以进行定量的活性评估。2.活性UGT1A3和UGT1A9在Bac-to-Bac^?表达系统中的异源表达本实验以Bac-to-Bac^?杆状病毒感染的Sf9昆虫表达系统来获得大量高活性的UGT1A3和UGT1A9重组蛋白。实验首先以pcDNA3.1（+）-UGT1A3*2a为模板,经过PCR扩增和定点突变获得需要的UGT1A3*1野生型序列,并通过引物设计插入了6个组氨酸的His-tag序列,将该基因序列连入pFastBac^TM1载体中。同时以pcDNA3.1（+）-UGT1A9质粒为模板,运用PCR在基因的两侧加入AflⅡ和XhoⅠ的酶切位点,连入pFastBac^TM1载体,构建了pFastBac^TM1-UGT1A9重组质粒。重组pFastBac^TM1-UGT1A9,pFastBac^TM1-UGT1A3质粒在MAX EfficiencyDH10Bac^TMcompetent Escherichia coli中发生转座,以PCR鉴定转座产生的重组粘粒。将重组粘粒与阳离子脂质体结合后转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,感染Sf9细胞,72 h后收集蛋白,采用RT-PCR和Western blot进行蛋白表达鉴定。为了检测表达蛋白的体外活性,我们以槲皮素为底物,对UGT1A3/UGT1A9重组酶进行了酶活性初试。在含有UDPGA的葡萄糖醛酸体外孵育系统中,重组UGT1A3酶和UGT1A9酶均代谢槲皮素产生4个槲皮素葡萄糖醛酸苷,这与人肝微粒体孵育结果相同。在Sf9细胞中获得的重组蛋白在前100 min的孵育中呈现良好稳定的活性,其活性明显高于用V79,CHL细胞系获得的人UGT1A9和UGT1A3.2重组蛋白,且满足本实验检测条件的灵敏度要求,该方法产生的代谢酶可以用于后续实验的定量研究。二.UGT1A3和UGT1A9对槲皮素的区域选择性研究槲皮素,这一广泛分布的饮食类黄酮,在体内几乎只能检测到其代谢物,故其行使药理活性,至少部分通过代谢物进行。葡萄糖醛酸结合是槲皮素吸收后的主要结合途径,不同的槲皮素葡萄糖醛酸苷具有显著不同的药理活性。因此,UGT酶对槲皮素各个羟基的区域选择性可能决定了该酶对槲皮素药理活性的贡献。在本实验中,从Bac-to-Bac^?表达系统中获得的UGT1A3和UGT1A9被用于催化槲皮素的葡萄糖醛酸结合反应,它们对于槲皮素各羟基的区域选择性通过各个羟基的动力学参数计算定量评估。LC-MS实验结果表明,两个酶都催化槲皮素生成4个槲皮素单葡萄糖醛酸苷。经HPLC分离后,我们收集了每个单葡萄糖醛酸苷,并利用黄酮的UV光谱确定了每个苷的结构,它们分别是槲皮素7-,3-,4’-和3’-葡萄糖醛酸苷。每个单葡萄糖醛酸苷的酶动力学参数被确定,并用于定量分析UGT1A3和UGT1A9对槲皮素的区域选择性。UGT1A3最偏好生成3’-葡萄糖醛酸苷,然后是3-,4′-和7-葡萄糖醛酸苷。考虑到槲皮素-3’-葡萄糖醛酸苷的低抗氧生理活性以及UGT1A3本身较弱的槲皮素总催化活性,表明UGT1A3在槲皮素的药理活性中只扮演一个有限的角色。而对UGT1A9来说,催化效率的顺序是3-＞7-＞3′-＞4′-葡萄糖醛酸苷,槲皮素-7-葡萄糖醛酸苷的高抗氧活性和以及UGT1A9较强的槲皮素总催化活性,表明UGT1A9对于槲皮素的生理活性十分重要。UGT1A3和UGT1A9对于槲皮素羟基的区域选择性在测试时间内不随时间发生变化。三.UGT1A3和UGT1A9对黄酮类的代谢研究黄酮是最常见和广泛分布的一类多酚化合物,黄酮的很多健康有益特性已经通过体外实验被报道。如果不了解黄酮的体内生物利用度、与胃肠道的相互作用、结合、代谢等情况,就无法由体外实验预测其体内的抗氧化活性。葡萄糖醛酸结合是黄酮吸收后三条主要的结合途径之一。本文中,重组UGT1A3和UGT1A9被用于19个黄酮底物的结合研究,其中的11个化合物能够被UGT1A3或者UGT1A9代谢。异鼠李素,桑色素,水飞蓟,山萘酚,黄豆苷元,槲皮素-3’,4’-OCHO-,槲皮素吡喃木糖苷和扁蓄苷是本文首次报道的UGT1A3底物。而芹菜素,桑色素,黄豆苷元,槲皮素-3’,4’-OCHO-,槲皮素吡喃木糖苷和扁蓄苷也是从未报道的UGT1A9底物。一个黄酮底物通常产生多个葡萄糖醛酸苷,但丰度并不相同,表明UGTs酶对黄酮的多个羟基存在区域选择性催化。LC-MS分析表明,这两种酶都只能催化形成黄酮的单葡萄糖醛酸苷,而不能形成双葡萄糖醛酸苷。动力学分析显示,人类的UGT1A3和UGT1A9更倾向于催化黄酮的苷元而不是糖苷,它们对大部分黄酮苷元,尤其是黄酮醇,都有较高的催化活性,但是这种催化效率(V_max/K_m)随黄酮苷元的结构改变而改变。UGT1A9的总体催化效率要高于UGT1A3,表明它在黄酮类葡萄糖醛酸结合反应中的重要作用。四.UGT1A3变异体的功能及在中国人群中的分布UGTs基因呈高度多态性。与细胞色素P450酶系相似,UGTs的遗传变异也可能导致不同的表型,引起药物效率和外源物毒性差异。一些人类UGTs基因,如UGT1A1,的遗传多态性已经被广泛报道,并具有临床相关的意义。2004年,在德国-高加索和日本人群中,新鉴定了6个UGT1A3单核苷酸多态性（SNPs）。这其中,4个SNPs(A17G,Q⁶R;T31C,W¹¹R;C133T,R⁴⁵W和T140C,V⁴⁷A)引起氨基酸的突变,2个SNPs是静默突变(G81A,E²⁷E和A477G A¹⁵⁹A)。这些SNPs共导致1个野生型UGT1A3.1和4个变异体（UGT1A3.2,UGT1A3.3,UGT1A3.4和UGT1A3.5）。在先前的报道中,这些UGT1A3变异体在雌激素代谢方面显示显著不同的活性。但是,它们对于其它底物的代谢活性还不知道。在本实验中,野生型和变异的人类UGT1A3酶被表达于Bac-to-Bac^?杆状病毒表达系统中。我们使用6种广泛分布的黄酮,槲皮素,木犀草素,山萘酚,水飞蓟,桑色素和异鼠李素,作为底物,来检测UGT1A3变异体对黄酮葡萄糖醛酸结合活性的差异。UGT1A3.4对所有测试黄酮的活性都有显著增加,催化效率(V_max/K_m)是野生型UGT1A3.1的3.6～7.8倍。而UGT1A3.2和UGT1A3.3则导致葡萄糖醛酸结合活性显著下降,它们对于大部分测试黄酮的活性甚至低于野生型的20%。UGT1A3.5只引起微弱的活性差异。此外,所有变异体对于槲皮素底物的区域选择性变化也被进行了研究。UGT1A3.2,UGT1A3.4和UGT1A3.5对高活性的槲皮素7-和3-葡萄糖醛酸苷的偏好远大于野生型,可能使人体对黄酮的反应发生变化。UGT1A3 45位,47位氨基酸及其附近区域可能是其活性相关的重要位点。本实验也首次确定了UGT1A3各等位基因和几个UGT1A3SNPs在中国汉族人群中的分布。部分UGT1A3等位基因和UGT1A3的SNPs在中国汉族人群中的分布显著不同于日本人群和德国高加索人群。如UGT1A3*4,在中国人群中的分布比德国高加索人群高得多,比日本人群的分布低得多。但总体来说,这些等位基因或SNPs的分布与日本人群的差异度较小。UGT1A3.4在对槲皮素的总葡萄糖醛酸结合效率上显示了464%的增长,并且对生成高活性的槲皮素葡萄糖醛酸苷有明显倾向性。UGT1A3.3在对槲皮素的总葡萄糖醛酸结合效率显著下降,且易生成低活性的槲皮素葡萄糖醛酸苷,槲皮素在具有这两个变异体UGT1A3蛋白的人群中的生理活性可能不同于普通人群。