农杆菌介导玉米幼胚遗传转化研究

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:venus521
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玉米是重要的粮食作物和饲料作物,建立农杆菌介导的优良玉米自交系的遗传转化体系,对玉米基因工程育种具有十分重大的意义。本研究以6个玉米优良自交系郑58、综3、87-1、137、K12和昌7-2的幼胚为材料,详细研究了影响农杆菌介导玉米转化的各种因素,建立了优良自交系的遗传转化体系。主要研究结果如下:1.幼胚被认为是玉米遗传转化中最为理想的外植体,本研究以玉米骨干自交系郑58、综3、87-1、137、K12和昌7-2的幼胚为材料进行愈伤组织诱导和长期继代培养基筛选。结果表明:添加不同成分的D培养基与N6B5基本培养基对愈伤组织诱导和继代存在明显差异,其中D培养基适合进行郑58和综3初级愈伤组织的诱导,而N6B5基本培养基则适合于进行87-1和137初级愈伤组织的诱导。2.试验以玉米自交系综3为材料,通过正交试验对影响愈伤组织诱导的各因素进行分析,找出了愈伤组织诱导的最佳实验体系。结果表明:在初级愈伤组织诱导过程中,脯氨酸(L-pro)对其影响最为显著,2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、硝酸银(AgNO3)、天冬酰胺(L-Asn)因素影响次之,水解酪蛋白(CH)因素影响较弱,其最佳搭配为: L-pro 500mg/L、L-Asn 800mg/L、CH 1000mg/L、2,4-D 3.0mg/L、AgNO3 12mg/L;而在胚性愈伤诱导过程中,各因素的最佳搭配为: L-pro 500mg/L、L-Asn 500mg/L、CH 2000mg/L、2,4-D 2.5mg/L、AgNO3 8mg/L;在继代过程中通过调节pH值、改变硝酸银及水解酪蛋白的用量可以防止愈伤水渍化、褐化、并能调节细胞渗透压,得到致密的胚性愈伤组织。3.本试验选用D培养基与N6B5基本培养基对郑58、综3和87-1三种玉米幼胚胚性愈伤组织进行了长期继代及胚性保持研究,结果表明:在脯氨酸(L-pro) 500mg/L、天冬酰胺(L-Asn )800mg/L、水解酪蛋白(CH) 500mg/L、2,4‐二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.5mg/L、硝酸银(AgNO3)8mg/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.3mg/L,培养温度为16℃,继代周期为30天的实验体系下,有利于胚性愈伤组织的长期继代及胚性保持。4.以玉米骨干自交系郑58的幼胚为材料,用农杆菌介导法对诱导培养出的II型胚性愈伤组织进行三价植物表达载体(pBI121-Bar/Chi-Glu,带有木霉几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因,同时含有筛选标记bar基因,赋予植物材料抗除草剂Basta抗性)的遗传转化,同时对影响转化效率的主要因素进行了研究。结果表明,当浸染液和共培养培养基中乙酰丁香酮(AS)浓度为150 mg/L,能显著提高抗性愈伤组织获得率,平均高出17.39%;在菌液浓度(OD600)为0.3、浸染时间为20 min、共培养时间为60h、共培养温度为22℃、共培养培养基pH为5.4以及头孢霉素(Cef)浓度为400 mg/L的试验体系下,有利于提高抗性愈伤组织的获得率,最高可达17.26%。这一体系的建立,为进一步将有用基因导入玉米优良自交系奠定了基础。
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