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第一部分 lncRNATUG1在脑组织缺血再灌注损伤中的作用背景:近年来,随着我国人民的生活水平的提高和人口老龄化,缺血性脑卒中发病率越来越高,成为我国人民死亡的主要原因。而我们在临床上也发现当缺血性脑卒中恢复血液灌注时,其损伤程度将更为严重。研究表明脑缺血后发生在缺血半暗带的过度的炎症反应是造成继发性脑损伤的主要原因:抑制炎症介质的过度表达可以减轻脑缺血后继发性脑损伤,而激发抗炎信号通路则可能加重继发性脑损伤。如何有效地保护大脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CRI)成为摆在我们面前的一道难题。而近期不断有研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在心脑血管保护的调控中发挥着重要作用。本研究的目的是利用星形胶质细胞(astrocyte,AS)系缺氧/复氧(oxygen deficit/reoxygenation,OGD/RX),研究 lncRNA 牛磺酸上调基因 1(taurine upregulated gene 1,TUG1)与CRI的关系。方法:通过培养小鼠AS系MA-C细胞(购自北京冬哥生物科技有限公司)进行实验,建立OGD/RX模型,分成四组:正常对照,低氧6h/复氧6h组,低氧6h/复氧24h组,低氧6h/复氧48h组。利用定量实时聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)测量 lncRNATUG1 的表达,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测细胞损伤程度和流式细胞仪检测细胞的凋亡程度,比较以上四组lncRNA TUG1之间的差异,并进一步发掘lncRNA TUG1在保护大脑缺血再灌注损伤中的作用。利用三种不同小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰lncRNATUG1的表达,显示lncRNATUG1的脑保护作用还是否存在。结果:RT-PCR检测,结果提示OGD/RX后,lncRNA TUG1表达明显上升(P<0.05)。LDH检测结果显示lncRNATUG1 siRNA对OGD引起损伤有保护作用(P<0.05)。流式细胞仪检测细胞凋亡检测说明lncRNATUG1 siRNA干预后,细胞凋亡明显减少(P<0.05)。结论:lncRNA TUG1在OGD/RX后起重要作用,它能加剧细胞的凋亡,如果抑制lncRNATUG1的表达,细胞凋亡数量将明显减少。第二部分 lncRNATUG1通过调控AQP4发挥作用目的:考虑到我们之前研究发现AQP4在CRI中发挥重要作用,我们猜测lncRNA TUG1是否通过调控AQP4发挥作用。方法:我们利用AS系siRNA成功干扰AQP4的表达后,建立OGD/RX模型,然后分别用untreated、TUG1 siRNA处理,观察TUG1对细胞的损伤作用是否存在。用RT-PCR和蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测TUG 1 siRNA干扰后,AQP4的表达情况。并用AQP4 siRNA干扰AQP4的作用,检测AQP4受干扰后,细胞LDH浓度是否改变。流式细胞仪检测细胞凋亡,检测AQP4受干扰后,TUG1有没有进一步对细胞的损伤作用。结果:WB结果显示TUG1 siRNA干扰后AQP4的表达下降(P<0.05)。AQP4的作用受干扰后,LDH结果显示TUG1的作用消失,流式细胞仪结果显示AQP4受干扰后,TUG1没有进一步对细胞的损伤作用。结论:lncRNATUG1对细胞的损伤作用是通过AQP4的表达变化来实现。第三部分 lncRNA TUG1调控AQP4的机制——通过吸附miR-145的表达目的:检测TUG1对AS的损伤作用的调控是否通过吸附miR-145来调控AQP4的表达而实现。方法:我们用Starbase软件预测TUG1与miR-145结合位点;用RT-PCR检测TUG1 siRNA 转染前后,miR-145 表达变化;用 miR-145(mimics 和 inhibitor)处理 AS细胞,观察处理前后AQP4的表达变化。AS用miR-]45 inhibitor预处理后,然后分别用untreated和TUG1 siRNA 1处理(inhibitor预处理的细胞,培养24小时后再用TUG1 siRNA转染6小时),建立OGD/RX模型观察TUG1 siRNA对细胞的保护作用是否存在。LDH检测,先用miR-145inhibitor处理后,建立OGD/RX模型,观察损伤是否加重;再用TUG1 siRNA处理,观察TUG1 siRNA的保护作用是否还存在。流式细胞仪检测凋亡,miR-145 inhibitor处理后,再用TUG1 siRNA处理,siTUG1的保护作用是否存在;AS用TUG1 siRNA 1成功干扰后,然后分别用untreated和miR-145 inhibitor处理(TUG1 siRNA预处理的细胞,培养6小时再用miR-145 inhibitor处理6h),建立OGD/RX模型,观察TUG1 siRNA对细胞的保护作用是否还存在。LDH检测结果显示,TUG1干扰后,细胞损伤是否减轻;再用miR-145 inhibitor作用,观察保护作用是否消失。结果:(1)在正常情况下,WB结果显示miR-145可以介导AQP4表达的调控作用,当miR-145表达上升时,AQP4的表达下降(P<0.001),当miR-145表达受到抑制时,AQP4的表达升高(P<0.001)。(2)在OGD/RX后,WB结果显示与正常对照组相比AS细胞中AQP4表达明显增加(P<0.01),而添加miR-145后,AQP4的表达显著降低(P<0.001),而抑制miR-145的作用后,AQP4的表达升高,甚至明显高于未干预的OGD/RX后的AQP4表达(P<0.01)。(3)在正常情况下,我们通过RT-PCR结果显示TUG1也可以介导miR-145的表达,当TUG1的作用受到干扰时,miR-145的表达升高(P<0.05)。(4)LDH检测细胞毒性实验显示,OGD/RX后细胞中的LDH含量与正常对照组相比明显升高(P<0.01),而添加miR-145 inhibit后,细胞中的LDH与未添加的OGD/RX后的细胞相比进一步升高,并添加siTUG1后,细胞中的LDH无明显变化。(5)流式细胞仪结果显示:与正常对照组相比,OGD/RX后,细胞的凋亡率明显增加(P<0.001),OGD/RX+miR-145 inhibitor处理后,细胞的凋亡率进一步增加(P<0.01)。而添加了 miR-145 inhibitor的OGD/RX细胞后,再添加siTUG1后,细胞的凋亡率无明显改变。但如果未添加miR-145 inhibitor的OGD/RX细胞,添加siTUG1后,细胞的凋亡率明显下降(P<0.01)。结论:lncRNA TUG1和AQP4的表达介导OGD/RX后AS细胞的损伤和凋亡是通过miR-145的调控而实现的。第四部分 体内实验证实lncRNATUG1参与调控CRI损伤目的:通过对C57/BL6雄性小鼠进行和小鼠大脑中动脉阻断(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型实验,模拟大脑缺血再灌注损伤,观察TUG1是否参与CRI损伤。方法:将C57/BL6雄性小鼠分成假手术组,MCAO组,MCAO+Negative shRNA组和MCAO+TUG1 shRNA组。通过计算脑梗死区域的面积,神经功能学评分和TUNEL染色来证实TUG1是否参与调控大脑缺血缺氧再灌注损伤。结果:(1)小鼠MCAO后梗死面积增加,侧脑室注射Negative shRNA后梗死面积无明显改变,但侧脑室注射TUG1 shRNA后梗死面积显著减少(P<0.01)。(2)小鼠MCAO后,bederson评分与假手术组相比非常显著增加(P<0.001),而侧脑室注射Negative shRNA后,bederson评分与MCAO组相比无明显差异,而侧脑室注射TUG1 shRNA后,bederson评分明显下降(P<0.01)。(3)小鼠MCAO后,与假手术组相比,细胞凋亡数显著增加(P<0.01),而侧脑室注射Negative shRNA后,细胞凋亡数与MCAO组无明显差异,然而侧脑室注射TUG1 shRNA后,细胞凋亡数显著较少(P<0.001)。结论:当发生CRI时,TUG1的作用受到干扰后,可以保护AS细胞免受缺血缺氧再灌注损伤。