第一部分长链非编码RNA对肝癌干细胞的调控作用及分子机制研究背景和目的肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,每年有超过700,000例病人被确诊为肝癌,而这一数字仍呈现上升态势。虽然近年来肝癌的预防、诊断和治疗水平有了长足的进步,但由于肝癌发病机制十分复杂,治疗效果仍然不理想。早期发现的肝癌病人,可以采取手术切除的治疗方法,而大部分患者在确诊时已经处于中晚期,失去了手术机会,只能采取化疗或靶向治疗等方法。肝癌对化疗并不敏感,而索拉非尼的靶向治疗效果也非常有限,使得肝癌预后差、复发高的现状并没有根本改观。因此,寻找可靠有效的肝癌治疗新靶点已迫在眉睫。随着肿瘤研究的深入,科学家发现肿瘤组织是由处于不同分化阶段的细胞组成的,其中存在极少量具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,被称为“肿瘤干细胞”(cancer stem cells,CSCs)。目前,在白血病、胶质瘤、乳腺癌、肺癌和结肠癌等多种肿瘤中均发现了CSCs的存在。有研究证实,在肝癌中也存在肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs),并可以利用CD133、CD90、Ep CAM、OV6和CD24等表面标志物鉴定。LCSCs被认为是肝癌发生发展、复发转移和耐药的根源,靶向LCSCs已经成为肝癌治疗的热点和新方向。但LCSCs的调控机制目前仍十分不清楚,阐明LCSCs的调控机制对了解肝癌的发病机理和寻找新的治疗策略具有十分重要的作用。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)是指长度大于200 nt,开放阅读编码框短于50~100 nt的RNA,具有m RNA样结构,部分lnc RNA经过剪切加工可以产生poly A尾,其表达具有时间特异性和空间特异性。lnc RNA在真核生物中广泛存在,参与了多种生理、病理过程的调节。已有研究显示,在肝癌中存在多种lnc RNA的表达改变,比如lnc RNA MVIH、MALAT-1、HULC和H19等,这些lnc RNA通过不同方式调控基因表达,参与了肝癌的发生发展。LCSCs在肝癌的发生发展、复发转移和化疗耐药中都发挥了关键作用,但目前lnc RNA在LCSCs中的调控作用研究仍处于起步阶段,需要进行更全面更深入的探索。深入探究lnc RNA在LCSCs调控中的生物学作用及分子机制,必然会为寻找肝癌新的预后判定标志物及治疗靶点带来新方向和新希望。本课题拟通过高通量的lnc RNA芯片结合经典的分子生物学筛选出LCSCs特异性lnc RNA,并结合体外、体内实验探明其对LCSCs的调控作用;进一步从肿瘤干细胞调控网络入手,结合lnc RNA独特的作用方式,寻找其作用靶点和调控的信号通路,进而阐明其调控LCSCs的分子机制;开展临床相关研究,分析lnc RNA与肝癌临床病理及患者预后的相关性,探讨其作为肝癌预后判定标志物及治疗靶点的可行性。希望通过本课题的实施,为肝癌的诊疗提供新思路和新靶标。研究方法1.肝癌干细胞特异性lnc RNA的筛选鉴定:(1)利用多种肝癌细胞系富集LCSCs,进行高通量lnc RNA芯片和m RNA芯片检测,通过生物信息学分析进行分层聚类,并构建基因共表达网络,筛选得到感兴趣的LCSCs特异性lnc RNA(lnc-DILC)。(2)在利用多种分选技术从多种细胞系中富集的LCSCs样本中,通过real-time PCR技术验证lnc-DILC的表达。(3)通过5’及3’c DNA末端快速扩增实验确定lnc-DILC的转录起始位点和终止位点,并获得lnc-DILC全长序列。(4)克隆并构建含增加ATG密码子的lnc-DILC全长的表达质粒,并通过western blot实验验证lnc-DILC的蛋白编码能力。2.lnc-DILC调控肝癌干细胞生物学作用的研究:(1)利用慢病毒建立稳定干扰/过表达lnc-DILC的肝癌细胞系。(2)采用上述细胞系通过低粘附成球培养富集LCSCs,进行LCSCs特异性标志物检测、干性相关转录因子表达检测和成球实验等实验,明确lnc-DILC对LCSCs的调控作用。(3)采用NOD-SCID小鼠体内有限稀释实验及皮下荷瘤实验,检测lnc-DILC对LCSCs在小鼠体内成瘤性和肿瘤生长的影响。(4)利用特异针对lnc-DILC的si RNAs重复上述实验,验证lnc-DILC调控LCSCs的生物学作用。3.lnc-DILC的作用机制探究:(1)利用干扰lnc-DILC的肝癌细胞系通过成球培养富集LCSCs后,进行干细胞相关信号通路PCR芯片检测,筛选LCSCs中受lnc-DILC调控的干细胞相关信号通路。(2)通过western blot、报告基因检测、细胞免疫荧光和免疫组化染色实验,检测干扰/过表达lnc-DILC细胞系中IL-6/STAT3信号通路的变化。(3)使用JAK2和STAT3的特异性抑制剂进行成球实验和克隆形成实验,明确lnc-DILC通过抑制IL-6/STAT3信号通路调控LCSCs扩增。(4)通过real-time PCR和ELISA检测干扰/过表达lnc-DILC系中IL-6表达和分泌水平的变化。(5)使用IL-6受体的竞争性抗体进行成球实验和克隆形成实验,明确lnc-DILC通过抑制IL-6自分泌调控LCSCs扩增。(6)将LM3细胞进行核浆分离,抽提RNA后PCR检测lnc-DILC的亚细胞定位。(7)通过IL-6启动子区序列分析和Biotin pull down实验,检测lnc-DILC直接结合IL-6启动子。(8)向干扰/过表达lnc-DILC的肝癌细胞系转入lnc-DILC的mimics/decoy及突变体,进行成球实验,验证lnc-DILC与IL-6启动子的结合位点,并证明lnc-DILC通过直接结合IL-6启动子抑制LCSCs扩增。(9)采用特异针对lnc-DILC的si RNAs,验证lnc-DILC调控LCSCs的分子机制。4.检测lnc-DILC在TNF-α/NF-κB与IL-6/STAT3两条信号通路间的作用:(1)干扰lnc-DILC的细胞系给予TNF-α和IL-1β刺激,检测IL-6的变化。(2)过表达lnc-DILC的细胞系给予TNF-α和IL-1β刺激,检测IL-6的变化。5.lnc-DILC的临床相关研究:(1)通过real-time PCR检测lnc-DILC在癌旁和肝癌组织中的表达水平。(2)分离原代肝癌细胞,成球富集原代LCSCs,检测lnc-DILC在原代LCSCs中的表达情况,并分析lnc-DILC与Ep CAM、CD24等LCSC标志物的相关性。(3)利用原代肝癌组织,分析lnc-DILC与患者预后的关系,探讨lnc-DILC作为肝癌预后判定标志物的可行性。研究结果1.lnc-DILC在LCSCs中表达特异性降低。2.lnc-DILC全长2394 nt,不能编码产生蛋白。3.干扰lnc-DILC可促进LCSCs的扩增,而过表达lnc-DILC则抑制LCSCs的扩增。4.小鼠体内实验证实lnc-DILC可抑制LCSCs的成瘤性及小鼠皮下荷瘤的生长。5.在LCSCs中lnc-DILC调控JAK2/STAT3信号通路。6.JAK2和STAT3的特异性抑制剂均可消除lnc-DILC对LCSCs的调控作用。7.lnc-DILC通过调控IL-6的表达及自分泌抑制LCSCs的扩增。8.IL-6受体的竞争性抗体可消除lnc-DILC对LCSCs的调控作用。9.lnc-DILC通过序列互补结合IL-6启动子。10.lnc-DILC mimics及其decoy均可以消除lnc-DILC对LCSCs的调控作用。11.lnc-DILC可能通过与NF-κB竞争结合IL-6启动子,抑制TNF-α和IL-1β对IL-6表达的诱导。12.lnc-DILC在原代肝癌干细胞球中表达降低。13.在原代肝癌干细胞球中,lnc-DILC与LCSCs表面标志物Ep CAM、CD24、CD133、CD90的表达呈较强的负相关。14.临床研究表明,lnc-DILC低表达的肝癌患者明显比lnc-DILC高表达的肝癌患者预后差。15.多因素分析结果显示lnc-DILC是影响肝癌患者生存期的独立风险因素。结论本研究发现了首个在肝癌干细胞中表达降低并具有负调控作用的lnc RNA,命名为lnc-DILC,并证实lnc-DILC通过结合IL-6的启动子,调控IL-6/STAT3自分泌信号通路,抑制肝癌干细胞的扩增。我们还发现lnc-DILC可以调节TNF-α/NF-κB和IL-6/STAT3信号通路间的crosstalk,将肝脏炎症与肝癌干细胞有机的联结起来。临床相关研究显示lnc-DILC低表达的肝癌患者明显比lnc-DILC高表达的肝癌患者预后差。这些研究结果为肝癌干细胞的调控机制和lnc RNA的功能提供了新的理论,也为lnc RNA作为新的肝癌预后标志物和治疗靶点提供了有力证据。第二部分Shp2激活β-catenin信号通路促进肝癌干细胞扩增研究背景和目的肝癌是世界范围内第六大恶性肿瘤,其死亡率居世界第二位。尽管近年来肝癌的诊疗技术不断发展,但其早期诊断率低的现状没有根本改观,相当一部分患者在确诊时已经失去手术机会,只能采取肝动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)或分子靶向治疗等。但是,肝癌对常规化疗方法很不敏感,疗效极差。对于术后患者而言,肝癌的复发转移率依然居高不下。所以深入研究肝癌复发转移和化疗耐药的机制,寻找新的治疗靶点和干预策略非常重要。肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)具有自我更新能力和多向分化的特性,不但影响肝癌的发生发展,也是肝癌复发转移和化疗耐药的根源。但LCSCs的调控机制目前仍不清楚,这既是以LCSCs为靶标抑制肝癌复发转移和化疗耐药的瓶颈,也是目前肝癌研究领域的热点和重大科学问题。Shp2属于非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶,由PTPN11基因编码,含有2个SH2(Src-homology2)结构域。细胞内蛋白酪氨酸磷酸酶在细胞增殖中往往发挥负向调控作用,而不同的是,Shp2可以促进细胞生存和生长。有研究发现细胞受到细胞因子等增殖信号刺激后,胞内ERK信号通路的完全活化必须依赖Shp2。我们科室和国外合作单位前期建立了Shp2肝细胞特异性敲除的小鼠,却发现Shp2敲除可以促进DEN诱导的肝癌发生。然而我们最近的研究发现在大部分肝癌组织中Shp2表达升高且与肝癌的分化、转移密切相关。进一步研究证实Shp2通过激活Ras/Raf/Erk和PI3-K/Akt/m TOR信号通路促进肝癌细胞的生长和转移。事实上,像Shp2、JNK、STAT3、β-catenin等原癌基因在肝细胞内发挥了促生存的作用,因此在肝细胞特异性敲除这些分子后会导致细胞死亡和继发性炎症,最终促进肝癌的发生。Shp2在LCSCs中的调控作用目前仍不清楚,本课题拟结合体外、体内实验探明Shp2在LCSCs中的生物学作用;进一步采用报告基因、免疫共沉淀等手段,分析Shp2对β-catenin信号通路的调控作用,寻找其直接作用靶点,进而阐明Shp2调控LCSCs的分子机制;开展临床相关研究,分析Shp2与肝癌患者对术后TACE治疗反应性的关系,探讨其作为肝癌治疗靶点及肝癌个体化治疗标志物的可行性。希望通过本课题的实施,为肝癌的诊疗提供新思路和新靶标。研究方法1.分析Shp2与肝癌化疗抵抗和复发的关系:(1)利用real-time PCR和免疫组化技术,检测化疗抵抗肝癌移植瘤中Shp2的表达。(2)利用免疫组化技术检测肝癌原发组织与复发组织中Shp2的表达。(3)根据免疫组化染色评分,分析病人肝癌组织中Shp2的表达与肝癌复发的关系。2.检测Shp2在肝癌干细胞中的表达及生物学作用:(1)在利用多种分选技术从多种细胞系中富集的LCSCs样本中,通过real-time PCR技术检测Shp2的表达。(2)在原代LCSCs中检测Shp2的表达,并分析Shp2与LCSCs表面标志物和干性相关转录因子的表达相关性。(3)采用干扰Shp2细胞系,通过LCSCs标志物检测、成球实验和化疗药敏感性等实验,明确Shp2对LCSCs的调控作用。(4)通过体外有限稀释和体内有限稀释实验,检测Shp2对LCSCs比例及成瘤性的影响。3.Shp2的作用机制探究:(1)检测HGDNs样本及原代肝癌组织样本中Shp2的表达,分析与肝癌分化的关系。(2)利用real-time PCR,检测干扰Shp2细胞系与对照细胞系中肝细胞特异表达基因与干性相关转录因子的表达。(3)通过核浆分离、报告基因、real-time PCR实验,检测Shp2对β-catenin入核和活化的调控。(4)通过western blot、免疫共沉淀实验,明确Shp2在肝癌细胞和LCSCs中调控β-catenin信号通路的分子机制。(5)使用FH535抑制β-catenin活性,通过LCSCs表面标志物检测和成球实验,明确Shp2通过激活β-catenin调控LCSCs扩增。4.Shp2在肝癌病人个体化治疗中的应用研究:在原代肝癌组织中分析Shp2表达与病人对术后TACE治疗反应性的关系。研究结果1.Shp2在化疗抵抗肝癌移植瘤中表达升高。2.与肝癌原发组织性比,Shp2在肝癌复发组织表达增加,与肝癌复发相关。3.Shp2在LCSCs中表达特异性升高。4.体外研究发现干扰Shp2抑制LCSCs的自我更新和扩增。5.体内有限稀释实验证实干扰Shp2可抑制肝癌细胞的体内成瘤性。6.Shp2的表达与肝癌组织分化程度相关。7.在肝癌细胞中,Shp2通过抑制CDC73磷酸化激活β-catenin,促进肝癌细胞去分化。8.在LCSCs中Shp2通过促进GSK3βSer9磷酸化,稳定β-catenin蛋白,促进LCSCs自我更新。9.FH535阻断β-catenin信号通路,可抑制Shp2对LCSCs扩增的调控。10.Shp2低表达的患者对术后TACE治疗反应性更好。结论在本研究中我们发现Shp2在肝癌细胞和LCSC中通过不同的分子机制激活β-catenin信号通路,促进LCSC的扩增。在肝癌细胞中,Shp2通过抑制CDC73的磷酸化激活β-catenin,促进细胞发生去分化;而在LCSC中,Shp2通过GSK3βSer9的磷酸化抑制β-catenin的蛋白降解,从而促进LCSC的自我更新。临床相关研究还发现肝癌组织中Shp2的表达水平与病人对术后TACE治疗的反应性相关,提示其可能可以作为肝癌个体化治疗的标志物。