论文部分内容阅读
脑胶质瘤(Glioma)是最常见的中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)肿瘤,治疗方法以手术为主,辅以放疗、药物化疗,但患者中位生存期不足15个月[1]。脑胶质瘤治疗效果不佳的最主要原因之一是血脑肿瘤屏障(Blood-Brain Tumor Barrier,BTB)的存在阻碍抗肿瘤药物进入脑肿瘤组织内[2-4],因此,开放BTB是脑胶质瘤的治疗前提和基础。本文首先探讨miroRNA-132-3p(miR-132-3p)对BTB通透性的影响及其作用机制。通过将永生化人脑血管内皮细胞hCMEC/D3与人胶质瘤细胞U87-MG共培养构建体外BTB模型,形成拟胶质瘤血管内皮细胞(Glioma Endothelial Cells,GECs)。与NECs(Normal Endothelial Cells,NECs)组相比,GECs 组 miR-132-3p 表达上调,同时蛋白质PTEN表达下调。通过生物信息学数据库的检索及实验验证,发现miR-132-3p通过与PTEN 3’非编码区(Untranslated Regions,3’UTR)特异性结合,对 PTEN mRNA 发挥转录后抑制作用,导致PTEN蛋白表达下调。高表达miR-132-3p导致GECs中霍乱毒素B亚基(Alexa 488 conjugated cholera toxin B subunit,AF488-CTB)标记的囊泡增加,说明miR-132-3p能够提高BTB体外模型跨细胞途径(Transcellular pathway)通透性;同时我们验证了 miR-132-3p对于BTB体外模型细胞旁途径(Paracellularpathway)的调节作用,发现miR-132-3p对BTB细胞旁途径通透性无显著影响。通过Western blot及免疫 细 胞 化 学(Immunocytochemistry,ICC)方 法 验 证miR-132-3p/PTEN/PKB/SRC/Caveolin-1 信号通路的作用;联合使用 PI3K/PKB 抑制剂LY294002、SRC抑制剂PP2以及PTEN过表达载体验证了该信号通路自上而下的调节作用。基于以上发现,分别在体内及体外水平,联合使用miR-132-3p与抗肿瘤药物阿霉素(Adriamycin,AMC)进一步验证了 miR-132-3p增加BTB跨细胞途径通透性的作用。综上所述,miR-132-3p.通过作用于PTEN 3’UTR,发挥对于PTEN mRNA的转录后抑制作用,下调PTEN蛋白表达,继而激活PKB/SRC/Caveolin-1信号通路,使pCaveolin-1蛋白表达上调,增加GECs囊泡的数量及功能,增加BTB跨细胞途径通透性。此外,我们研究了地塞米松(Dexamethasone,DEX)对BTB通透性的影响及其作用机制。结果表明,DEX能够增加AF488-CTB标记的GECs囊泡数量以及miR-132-3p的表达。前期实验结果表明miR-132-3p靶向PTEN 3’UTR,使PTEN蛋白表达下调,通过PTEN/PKB/SRC/Caveolin-1信号通路调节BTB跨细胞途径通透性,因此我们推测DEX可能通过上述信号通路调节BTB通透性,结果显示DEX下调PTEN表达,激活下游蛋白pPKB、pSRC,使下游pCaveolin-1上调,增加囊泡数量及功能。体外BTB通透性检测实验结果表明,DEX可增加BTB体外模型对AMC的渗透;大鼠胶质瘤模型瘤体AMC含量测定实验结果表明,DEX可显著增加大鼠胶质瘤内AMC的含量。综上所述,DEX 通过增加 GECs 中 miR-132-3p 表达,激活 PTEN/PKB/SRC/Caveolin-1 信号通路,而提高BTB跨细胞途径通透性。另外,我们研究了钙离子依赖性钾离子通道(Calcium-activated potassium channel)激活剂NS1619对于BTB通透性的影响机制。在大鼠胶质瘤模型中,颈内动脉灌注NS1619(0.9 mg/kg),孵育不同时间后检测Caveolin-1、FoxO1蛋白表达情况。BTB体外模型中,流式细胞术检测霍乱毒素B亚基(Cholera toxin subunit,CTB)标记的GECs内吞。结果表明,大鼠胶质瘤模型中,NS1619给药15 min组,Caveolin-1、FoxO1表达明显上调,同时体外BTB模型中,NS1619给药15 min,CTB标记的GECs内吞明显增加。而NS1619给药2h组Caveolin-1表达明显下调,但pFoxO1表达水平显著增高。此外,联合使用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)抑制剂MPG、PI3K抑制剂LY294002或PKB抑制剂曲西立滨(Triciribine)可逆转NS1619给药2 h组GECs中Caveolin-1的表达下调及pFoxO1表达上调,说明NS1619所介导的GECs转运囊泡增加与ROS/PI3K/PKB/FoxO1信号通路有关。因此,NS1619时间依赖性增加脑肿瘤血管内皮细胞囊泡的形成,进而增加BTB通透性。综上所述,本文分别阐述了 miR-132-3p/PTEN/PKB/SRC/Caveolin-1信号通路以及ROS/PI3K/PKB/FoxO1/Caveolin-1信号通路对于BTB通透性的影响,为脑胶质瘤的临床治疗提供了重要的实验依据。