随着我国国民经济水平和生活质量的提高,消费者对发酵乳品质及功能特性要求越来越高,已从“基本营养”逐步转向“绿色、健康、功能性”。当前,发酵乳生产企业大多采用直投式发酵剂,而中国直投式发酵剂市场被国外企业占去很大比例,尤其是含有益生菌的直投式发酵剂产品更是缺乏,这与我国乳品产业的迅猛发展及消费者日益增长的需求严重不符。此外,当前直投式发酵剂的发酵菌株以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为主,但研究发现这两株菌对人体胃肠道环境并不耐受。因此,开发具有自主知识产权的高活力直投式益生菌发酵剂具有重要的现实意义。经过本实验团队前期研究结果表明从巴马长寿老人体内分离出来的干酪乳杆菌LTL1361和罗伊氏乳杆菌LTR1318菌株具有优良的胃肠道耐受性,且展现出良好的抑菌、抗氧化等益生功效。因此,本文研究重点是将上述干酪乳杆菌LTL1361和罗伊氏乳杆菌LTR1318菌株制备成高活性的混合直投式益生菌发酵剂,优化其发酵工艺,并探究其发酵乳的贮藏性能。所获得主要研究结果如下:1.两种高活力直投式益生菌发酵剂制备。通过单因素和正交试验探究不同益生元分别对两株菌的增殖效果,得到两株菌的最优益生元配伍。罗伊氏乳杆菌LTR1318的最优益生元配伍为:0.4%低聚半乳糖,0.2%菊粉,0.8%水苏糖;干酪乳杆菌LTL1361的最优益生元配伍为:0.6%低聚果糖、0.2%菊粉和0.4%水苏糖;在MRS培养基的基础上,依据上述探究得到的两种最优益生元配伍进行培养基的改良,分别对两株菌进行增殖培养。再根据单因素实验结果进行了Plackett-Burman试验,分别找出影响两种益生菌冻干存活率的主效应因素,进行响应面实验和误差反向传播神经网络耦联遗传算法（BP-GA）进行冻干保护剂配比的优化。干酪乳杆菌LTL1361响应面模型优化结果为:10.53%脱脂乳、8.21%海藻糖、0.81%谷氨酸和3.84%甘露醇,BP-GA优化模型结果为脱脂乳10.32%、谷氨酸0.84%、海藻糖6.73%和甘露醇3.98%。同时分别对两种模型结果进行试验验证,响应面优化模型的冻干存活率为85.93%;BP-GA模型的实际冻干存活率为89.56%。罗伊氏乳杆菌LTR1318响应面模型优化冻干保护剂配方结果为:9.88%脱脂乳、6.80%麦芽糊精、3.70%低聚木糖和2.40%山梨醇,BP-GA优化模型结果为脱脂乳9.86%、6.58%麦芽糊精、3.85%低聚木糖和2.10%山梨醇。分别对两种模型实验验证,此时的冻干存活率为90.69%;BP-GA模型的实际冻干存活率为96.31%。综合对比而言,BP-GA优化模型拟合度更高,预测效果更好,更适合对冻干保护剂配方进行优化。2.混合直投式益生菌发酵剂发酵乳工艺优化。在制备高活力直投式益生菌发酵剂的基础上,通过单因素试验结果,结合响应面和径向人工神经网络耦联遗传算法（RBF-GA）进行工艺优化。响应面模型优化结果:混合发酵剂比例为2:1,发酵温度为39.7℃,接种量为3.83%;RBF-GA优化模型结果为发酵温度40℃、混合发酵剂比例2:1,接种量为0.4%。依据模型优化配方进行验证试验,响应面优化得到发酵乳综合评分为1.112,发酵乳活菌数为6.78×1010;RBF-GA优化得到发酵乳的综合评分为1.287,发酵乳活菌数为8.70×1010。通过对比发酵乳综合评分值和活菌数,利用RBF-GA模型优化结果均优于响应面优化模型,因此用RBF-GA优化模型优化混合直投式益生菌发酵剂发酵乳的工艺更合适。3.混合直投式益生菌发酵剂贮藏稳定性及发酵乳样品模拟胃肠道耐受和贮藏期特性变化。探究不同贮藏温度下混合直投式益生菌发酵剂的贮藏稳定性,发现当贮藏温度在-20℃时,发酵剂的稳定性最好且菌株损失得最少。探究传统酸乳和混合直投式发酵剂发酵乳对模拟胃肠道的耐受性,发现传统酸乳中的菌株对胃液的耐受力极低,而混合直投式益生菌发酵剂发酵乳在经过胃液3 h处理后,菌株的存活率仍达到89.47%,在肠液中也能较好生存。进一步探究了混合直投式益生菌发酵剂发酵乳和传统酸乳在贮藏期内持水力、脱水收缩作用敏感性、酸度和风味的变化,结果表明:混合直投式益生菌发酵剂发酵乳在贮藏期间相应微生物、理化性质均优于传统酸乳,且其在贮藏期间内部结构较为稳定。综上所述,本试验制备的混合直投式益生菌发酵剂发酵乳从模拟胃肠道耐受性和贮藏期组织稳定性等方面均优于传统酸乳。