第一部分大鼠海马CAl区星形胶质细胞对突触的影响目的:研究发育期大鼠海马CAl区星形胶质细胞(Astrocyte,AS)与突触数量、活性和成熟度的关系。方法:取健康初生(<24h)、幼年(28-30d)各20只;将80只成年鼠(90-100d)随机均分为成鼠组、阿糖胞苷组(侧脑室注阿糖胞苷)、美伐他丁组(侧脑室注美伐他丁)和盐水组(侧脑室注生理盐水),分别取脑、切片。用高压液相色谱法(high performance liquidchromatography,HPLC)检测海马CAl区胆固醇含量。用免疫组织化学方法标记大鼠海马CAl区的胶质纤维酸蛋白(glial fibrillary acidicprotein,GFAP)和突触素(synaptophysin,SPY)免疫反应产物,HE染色法显示神经元;应用Q-500显微图象处理系统测定GFAP、SPY免疫反应阳性信号密度值(光密度值),即免疫染色阳性信号的面积占当时视野面积的百分比的变化。并比较相邻免疫组化和HE染色切片来确定上述抗原的分布,以同切片未受损胼胝体和视束相应的免疫反应光密度值为背影;减去背影光密度值,以排除染色过程中非特异性染色误差。在电子显微镜下摄制大鼠海马CAl区照片,用XY-540型生物图像处理系统测量电镜照片中突触小体中囊泡数量、突触活性区长度、突触后致密物质(Postsynaptic Density,PSD)厚度、突触间隙宽度和突触界面曲率;观察突触和AS的形态,选取30个8000倍视野计算AS和突触数目。结果:(1).乳、幼和成鼠海马样品胆固醇含量分别为2.92±0.03、11.20±3.41和12.91±1.25 g/kg,相互间差别均有统计学意义(P<0.01)。(2).免疫组织化学定量显示,乳、幼和成鼠海马CAl区GFAP光密度值分别为2.53±1.76、50.81±1.56和96.62±4.12,SPY光密度值分别为0.095±0.003、0.189±0.004和0.328±0.023,差别均有统计学意义(P<0.01)。(3).电子显微镜下,成鼠组海马CAl区AS数量(9.5±1.2个/八千倍视野)和突触数量(16.3±1.4个/八千倍视野)均多于幼鼠组(AS 4.8±1.0、突触10.3±1.1个/八千倍视野),差别有统计学意义(P<0.01);乳鼠海马CAl区偶见AS,未见突触结构。成鼠海马CAl区突触成熟,突触前结构中囊泡量(Vesicles quant,VQ)多而密集,囊泡圆而清亮,突触后致密物(PSD)厚,突触间隙宽而活性区长,突触界面不对称,弯曲型为主。幼鼠海马CAl区突触不成熟,突触前结构中VQ少而透明,PSD簿,突触间隙宽而活性区长度短,突触界面较对称,直线型为主。成、幼鼠海马CAl区突触成熟度的差异有统计学意义(P<0.01)。(4).侧脑室注射阿糖胞苷后三天,大鼠海马CA1区AS和突触数目、GFAP和SPY之光密度值及胆固醇含量均降低,而侧脑室注射美伐他丁后只有胆固醇含量和突触数目降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:发育期大鼠海马CA1区AS与突触数量、活性和成熟度密切相关,胆固醇在其中起关键作用。第二部分谷氨酸对神经元内钙变化的影响目的:研究细胞外谷氨酸对原代培养的大鼠海马神经元内钙信号的影响。方法:取出生<24h的S D大鼠海马神经元,按照Larsen等的方法进行急性分离、原代培养。用显微荧光测量技术监测神经元内钙信号的动态变化和谷氨酸对其的影响;F340/F380的荧光比值被用来反映神经游离Ca2+浓度(intracellular free Ca2+concentration,[Ca2+]i)的变化,用Fura-2/AM孵育法加载Fura-2。分别改变细胞外谷氨酸作用时间、浓度,并分别用D-2-amino-5-phosphonopentanoic acid(D-AP-5)、6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione(CNQX)选择性拮抗N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)、a-氨基-3-羟基-5-甲基-异恶唑丙酸[alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid,AMPA]受体后,观察谷氨酸对神经元内钙信号影响的变化。结果:(1).谷氨酸可使神经元内游离钙浓度明显升高;100μmol/L的谷氨酸诱发的[Ca2+]i升高与谷氨酸的刺激时间相关,随着刺激时间的延长,荧光比值逐步增高,且从峰值下降所需的时间也逐渐延长;用不同浓度谷氨酸刺激同一细胞,随着刺激浓度升高,荧光比值逐步增高;刺激浓度大约1mmol/L时,荧光比值达高峰;刺激浓度为30mmol/L时,[Ca2+]i迅速、极度升高,荧光比值居高不下,提示细胞死亡。(2).谷氨酸刺激引起的胞内游离钙升高,可被100μmol/L D-AP-5或50μmol/L CNQX明显抑制,但抑制均不完全;同时用D-AP-5和CNQX则抑制更显著,但仍不完全。(3).在无钙细胞外液中,谷氨酸诱发的胞内游离钙升高幅度明显较小,D-AP-5和CNQX可使之进一步下降,但未消失。结论:原代培养的大鼠海马神经元内[Ca2+]i升高具有谷氨酸刺激浓度和时间的依赖性;NMDA和AMPA型谷氨酸受体均参与神经元质膜上的Ca2+转运;谷氨酸还可通过其它途径诱导胞内钙库释放。第三部分脑梗死大鼠运动训练后星形胶质细胞与突触和运动功能的变化目的:研究运动训练后大鼠脑梗死(cerebral infarction,CI)灶周边区AS、突触和脑梗死大鼠运动功能的变化。方法:实验大鼠共130只,按国际通行的方法复制大鼠肾性高血压模型,于形成肾性高血压第16周用线栓法制作右侧大脑中动脉闭塞模型。右侧大脑中动脉闭塞成功大鼠120只,10只未复制成功为正常组。在右侧大脑中动脉闭塞后随机各取40只大鼠,分为1、3、6周未时段组;每时段组又均分为康复组、抑制组、盐水组和对照组。抑制组30只大鼠于右侧大脑中动脉闭塞四天后在立体定位仪下侧脑室内注射25mg/ml的阿糖胞苷,每次2ml/kg,每七天一次。盐水组用同样方法以等量生理盐水注入侧脑室。康复组和对照组侧脑室不注入任何药物。康复组、盐水组和抑制组给予每天30min、每周5天的运动训练。以横木行走试验1～7分评分法评定运动功能。参照第一部分的内容,在制模成功第7、21、42 d分别用电子显微镜观察各组大鼠CI周边区AS、突触数目;用免疫组织化学方法观察其GFAP、SPY和生长相关蛋白43(growth associated protein,GAP-43)免疫反应光密度值,即免疫染色阳性信号的面积占当时视野面积的百分比的变化。并比较相邻免疫组织化学染色切片来确定上述抗原的分布,以同切片未受损胼胝体和视束相应的免疫反应光密度值为背影;减去背影光密度值,以排除染色过程中非特异性染色误差。每例标本被检测区各测3张切片,取其均值。结果:(1).运动功能恢复情况:康复组大鼠运动功能(3周末3.2±0.3分,6周末5.8±0.9分)得分较对照组(3周末1.8±0.5分,6周末2.6±0.8分)和抑制组(3周末1.6±0.9分,6周末2.1±0.7分)高p<0.01)。(2).电镜观察,康复组大鼠CI周边区AS(3周末5.8±0.3,6周末8.5±0.8个/八千倍视野)和突触数目(3周末12.3±1.3,6周末16.3±1.4个/八千倍视野)同步增多,两者均明显多于对照组和抑制组的数目(p<0.01)。(3).免疫组织化学染色观察,康复组大鼠CI灶周边区GFAP和SPY光密度值也同步增多,且在3、6周末均高于对照组和抑制组(p<0.01)。GAP-43光密度值在右侧大脑中动脉闭塞后1周末增高,第3周末降低至正常水平,康复组、盐水组、对照组及抑制组间GAP-43光密度值的差异无统计学意义。(4).盐水组与康复组上述指标间的差异无统计学意义。结论:运动训练可以促使大鼠CI周围的AS数目增多、活性增强,增加突触数量和活性,改善CI大鼠运动功能;AS增多和活化是其中最关键的环节。神经元生长和再生运动功能恢复过程中不起主要作用。第四部分运动训练诱发大鼠脑梗死周边区突触变化的机制目的探讨运动训练对大鼠脑梗死周边区突触变化的影响。方法按国际通行的方法复制大鼠肾性高血压模型,在形成肾性高血压第16周用线栓法制作右侧大脑中动脉闭塞模型。实验大鼠制模成功共150只,随机分为1、3、6周未时段组,各50只;每时段组又均分为康复组、盐水组、抑制组、美伐他丁组和对照组。抑制组、美伐他丁组大鼠各30只分别于右侧大脑中动脉闭塞四天后在立体定位仪下侧脑室内注射25mg/ml的阿糖胞苷、20mg/ml的美伐他丁,每次2ml/kg,每七天一次。生理盐水组用同样方法以等量生理盐水注入侧脑室。康复组和对照组侧脑室不注入药物。康复组、盐水组和抑制组给予每天30min、每周5次的运动训练。以横木行走试验1～7分评分法评定运动功能。参照第一部分的内容,在脑梗死7、21、42 d用免疫组织化学方法观察各组大鼠脑梗死周边区GFAP和SPY光密度值,即免疫染色阳性信号的面积占当时视野面积的百分比的变化。并比较相邻免疫组织化学染色切片来确定上述抗原的分布,以同切片未受损胼胝体和视束相应的免疫反应产物阳性信号为背影;减去背影阳性信号,以排除染色过程中非特异性染色误差。每例标本被检各区测3张切片,取其均值。以高压液相色谱法测定各组大鼠脑梗死周边区胆固醇含量。结果(1).康复组脑梗死周边区GFAP、SPY光密度值(%)和胆固醇含量(g.kg-1)均为脑梗死42 d(GFAP 28.47±2.32、SPY 61.42±2.32、胆固醇含量14.52±1.45)高于21 d(GFAP 19.54±3.12、SPY 43.22±3.14、胆固醇含量7.45±1.31)、21 d高于7 d(GFAP 11.02±2.01、SPY34.29±1.39、胆固醇含量4.50±0.24),差别均有统计学意义(p<0.01)。(2).对照组脑梗死周边区GFAP、SPY光密度值(%)和胆固醇含量(g.kg-1)亦在脑梗死后渐渐增高,7d(GFAP 9.37±2.12,SPY 32.1±0.16和胆固醇含量3.62±0.05)、21d(GFAP 14.57±1.42,SPY 36.64±0.01和胆固醇含量5.48±0.21)、42 d(GFAP 22.43±1.35,SPY 42.89±1.05和胆固醇含量8.76±1.20)间差别均有统计学意义p<0.01);但康复组各指标值均高于对照组的指标值,差别均有统计学意义p<0.01)。(3).抑制组脑梗死周边区GFAP(7d 7.35±1.27、21d 10.23±2.21、42 d11.13±1.41)、SPY(7d 30.06±1.24、21 d 31.34±1.22、42 d 29.94±2.31)光密度值(%)和胆固醇含量(7d 2.33±0.14、21d 3.17±3.37、42d4.21±3.25)(g.kg-1)均低于对照组的指标值(p<0.01),差别均有统计学意义(p<0.01)。(4).美伐他丁组脑梗死周边区GFAP光密度值(%)(7d11.25±1.37、21d 20.04±3.22、42 d 28.97±2.43)与康复组各GFAP光密度值间的差别均无统计学意义(p>0.05),但其SPY光密度值(%)[7d31.26±1.04、21d 31.21±1.12、42 d 30.22±1.96]和胆固醇含量(g.kg-1)[7d 2.32±0.13、21d 3.20±3.40、42 d 4.18±2.85]低于康复组和对照组的指标值,差别均有统计学意义(p<0.01)。(5).康复组与盐、水组各指标值间的差别均无统计学意义p>0.05)。结论运动训练可使大鼠脑梗死灶周边区突触活性增强、胆固醇含量增加;运动训练激活AS,分泌胆固醇是其重要机制。