肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma HCC)作为最常见的原发性肝癌,发病率在恶性肿瘤中排第五位;肝细胞肝癌治疗效果差,五年生存率低,死亡率在恶性肿瘤中居第三位。肝细胞肝癌的发生是由于肝脏的基础性疾病,特别与肝炎后肝硬化密切相关。在东南亚地区,HBV或者HCV感染引起的慢性肝炎是导致肝癌高发的主要原因。肝细胞肝癌发生的机制是非常复杂的,包括慢性炎症,过氧化应激及多种基因异常,例如研究最广泛的抑癌基因p53突变导致其失活,beta-catenin的突变,过表达多种ErbB受体家族,过表达MET受体,microRNA的异常表达以及表观遗传的异常等。这些因素都参与了肝细胞肝癌发生、发展及转移的生物学过程。大量研究表明microRNA在肝细胞肝癌的发生发展中具有重要的调控作用。Victor Ambros和GaryRuvkun于1993年报道了一类非编码的小分子RNA,即微小RNA(micro RNA,miRNA),此发现使人类重新认识到非编码RNA对于细胞的生命活动中具有重要的调控作用,开辟了分子生物学全新的研究领域。MicroRNA由22~24个核苷酸组成,属于进化保守的短链非编码RNA,剪切形成双链互补的RNA(dsRNA)。microRNA主要通过在转录后水平对基因实现调控,MicroRNA的靶向结合mRNA并非绝对严格的,即一个micro RNA可以结合多个甚至上百个基因编码的mRNA,从而实现对多个基因的调控。一般来讲,micro RNA主要与基因转录的mRNA的3’非翻译区(3’UTR)结合,从而促进RNA酶对其进行降解,或者抑制mRNA的翻译过程。最新的研究表明microRNA还能够与mRNA的5’非翻译区(5’UTR)及翻译区结合实现对基因的调控,还能够与长的非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(cRNA)结合,间接实现对基因表达的调控功能,而且microRNA对基因的表达调控功能不仅限于抑制基因的表达,还能通过促进mRNA的翻译过程,达到提高基因表达水平的功能。MicroRNA在发育、分化、增殖和凋亡中发挥着重要的调控作用,越来越多的研究发现在多种疾病中microrna的表达异常,并且这些microrna在疾病中的发生发展中发挥着重要的调控作用。近些年研究表明,在downsyndrome模型中,microrna1246(mir-1246)可做为p53基因的转录靶点,并且发现在肿瘤中形成一个mir-1246-dyrk1a-nfat信号传导通路发挥作用。目前在肝细胞肝癌中未见mir-1246的相关研究,本课题的研究目的是为了探讨mir-1246在人类肝细胞肝癌(hcc)中表达及其在肝细胞肝癌中发生发展中的生物学作用,以期寻找到hcc发病的新的分子机制,为hcc诊断或者治疗的新策略提供理论依据。基于上述研究背景和提出的科学问题,关于mir-1246在hcc细胞中的表达、生物学作用及分子作用机制,进行了如下研究:以六株hcc细胞系huh7、c3a、plc、hepg2、hep3b、sun387和正常肝细胞系lo2以及50例hcc临床样本为研究对象,首先通过真核细胞过表达和rnai技术研究p53基因和mir-1246表达的关系,进而采用实时定量pcr(qrt-pcr)检测hcc细胞系和临床样本中p53基因和mir-1246表达量,并且分析二者表达的关系。选择hcc细胞系hep3b和hepg2做为进一步的细胞研究模型,通过分别在两株细胞系中上调或者下调mir-1246表达量,检测此microrna对细胞增殖、克隆形成能力及侵袭的影响。基于细胞水平的研究,进而通过建立裸鼠肿瘤模型,探讨mir-1246在动物体内的生物学作用。通过生物信息学及荧光报告基因寻找并验证mir-1246的作用靶点nfib(nuclearfactori/b),通过rnai技术、mtt、克隆形成实验及细胞凋亡检测阐明其作用机制。通过westernblot、免疫组化、qrt-pcr技术检测了50对hcc临床样本组织和血清中的p53、mir-1246、nfib的表达,通过统计学分析确定在临床hcc样本中p53和mir-1246表达的相关性,mir-1246和nfib表达的相关性,以及hcc组织中mir-1246和血清中mir-1246表达的相关性,从而探讨p53-mir-1246-nfib通路的临床意义。本课题三部分的具体内容如下:第一部分:hcc细胞中p53基因诱导mir-1246的表达及其生物学功能目的:1在hcc细胞系hepg2、c3a中,p53基因是否能够诱导mir-1246的表达。2不同表达状态p53基因的hcc细胞系hepg2,c3a,hep3b,plc,huh7,sun387及临床hcc肿瘤组织中mir-1246表达情况。3体内和体外实验探讨mir-1246对hcc细胞的增殖、克隆形成能力、细胞迁移能力及成瘤能力的影响。方法:1构建pcdna3.1-p53真核细胞表达质粒,使用脂质体lipofectaminetm2000转染两株hcc细胞系hepg2和c3a,pcdna3.1空载质粒作为对照;合成p53基因特异性的小干扰rna(sirna-p53),进而使用interferin将此sirna转染hepg2和c3a,应用qrt-pcr技术检测mir-1246的表达水平。2采用qrt-pcr技术在表达不同状态的p53基因的六株细胞系中检测mir-1246的表达水平,以及在高表达和低表达p53基因的hcc组织中检测mir-1246的表达水平。3在hepg2和hep-3b细胞系中rna干扰或者过表达mir-1246,并采用mtt技术及克隆形成实验检测mir-1246对hepg2和hep-3b细胞的增殖和克隆形成能力的影响。4通过构建shrna-mir-1246的表达质粒,转染hepg2细胞筛选,获得稳定表达的克隆,细胞划痕实验验证mir-1246对hepg2细胞迁移能力的影响;进一步将稳定表达mir-1246的hepg2细胞接种到balb/c裸鼠皮下,进行裸鼠成瘤实验,体内观察mir-1246对于肿瘤生成的影响。结果:1hcc细胞系hepg2和c3a中干扰p53基因后,mir-1246表达显著下调(p<0.05);过表达p53基因后,mir-1246表达显著上调(p<0.05)。2在表达不同状态p53基因的hcc细胞系中,与表达野生型p53组比较,不表达p53组或者表达突变p53组,mir-1246的表达差异具有显著性(p<0.05),同时证明了在p53基因高表达的hcc临床样本组织中,mir-1246的量也相应高水平表达;反之,在p53基因低表达的hcc临床样本组织中,mir-1246的量也相应低水平表达,统计学差异显著(p<0.05)。3过表达mir-1246类似物的hep3b细胞增殖和克隆形成能力受到显著抑制(p<0.05),转染了mir-1246反义寡聚核苷酸后的hepg2细胞增殖和克隆形成能力显著增强(p<0.05)。4稳定转染了shrna-1246的hepg2细胞的划痕修复能力显著下降,说明mir-1246具有抑制细胞迁移的能力。5进一步体内实验证实,过表达shrna-1246hepg2细胞克隆在裸鼠中形成成瘤体重量显著低于对照组的肿瘤重量(对照组肿瘤平均重量为0.56±0.10g,而实验组肿瘤的平均重量为0.32±0.07g,统计分析表明,两组数据差异显著(p<0.05)。结论:1在hcc细胞系中p53能够诱导mir-1246表达,并且在hcc患者组织中p53mrna与mir-1246的表达水平具有一致性。2mir-1246具有调控hcc细胞增殖、细胞克隆和迁移能力的作用。3裸鼠成瘤实验表明mir-1246具有抑制hepg2细胞在裸鼠中的成瘤能力。4p53基因诱导的mir-1246具有抑制hcc发生、发展的生物学功能。第二部分:hcc细胞系中mir-1246靶向调控nfib的作用机制研究目的:1以六株hcc细胞系hepg2、c3a、hep3b、plc、huh7、sun387及正常肝细胞系lo2为研究对象,预测及寻找mir-1246直接作用靶基因。2探讨mir-1246对靶基因nfib的影响及二者间的相关性。3在hcc细胞系中探讨nfib对细胞增殖、克隆形成及细胞凋亡的影响。方法:1通过miranda,pictarand和targetscan数据库分析,预测出nfib基因可能是mir-1246的作用靶点,通过构建包含nfib的3’utr及nfib的3’utr突变的荧光素酶报告基因,在hepg2细胞中通过共转荧光素酶报告基因与mir-1246或者mir-1246aso探讨mir-1246是否直接与nfib的3’utr结合。2通过在hepg2和hep3b细胞系中转染mir-1246和mir-1246aso及相应的对照寡居核苷酸,应用qrt-pcr和westernblot检测nfib的mrna和蛋白质水平的变化。3在hcc细胞系hepg2细胞中,通过采用sirna技术干扰nfib基因的表达,采用mtt检测技术,克隆形成能力及凋亡检测实验探讨nfib对hepg2细胞的增殖、克隆形成能力及凋亡的影响;共同过表达mir-1246和nfib基因、mir-1246、mir-对照,探讨mir-1246靶向nfib发挥抑制肿瘤形成的作用。4通过westernblot技术检测和qrt-pcr表达不同状态的p53基因的六株hcc细胞系hepg2、c3a、hep3b、plc、huh7、sun387中nfib和mir-1246的表达水平,探讨mir-1246的表达与nfib的蛋白表达水平的相关性。结果:1通过生物信息学分析及荧光报告基因检测表明mir-1246能够直接结合nfib的3’utr;2在改变hepg2和hep3b细胞中的mir-1246表达水平后,qrt-pcr实验表明mir-1246不影响抑制靶基因nfibmrna的表达;在改变lo2、hepg2、c3a、hep3b、huh7、plc细胞中的mir-1246表达水平后westernblot实验表明下调了nfib的蛋白的表达。3sirna-nfib抑制nfib基因的表达后,进一步通过mtt,软琼脂克隆形成实验及流式细胞术(facs)凋亡检测证实细胞增殖及克隆形成能力显著受到抑制(p<0.05);并且细胞的凋亡显著增加(p<0.05);共同过表达mir-1246和nfib基因、mir-1246、mir-对照证实mir-1246靶向nfib发挥抑制肿瘤形成的作用(p<0.05);4p53不同表达状态六株hcc细胞系hepg2、c3a、hep3b、plc、huh7、sun387中,表达野生型p53hcc细胞系hepg2、c3a中nfib蛋白显著低于其他四种细胞系(p<0.05),graphpad统计软件分析证实了在hcc细胞系中nfib和mir-1246的表达呈现负相关(相关系数r=-0.8940,p<0.05)。结论:1mir-1246能够通过与nfib的3’utr结合调控nfib的蛋白质的表达,没有改变其mrna表达水平。2干扰nfib基因的表达能够抑制hcc细胞hepg2的增殖,能够促进细胞的凋亡;过表达nfib基因能够逆转mir-1246抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的生物学效应。3nfib蛋白与mir-1246的表达在hcc细胞系中呈负相关,nfib基因是mir-1246的作用靶点,说明mir-1246是通过靶向nfib基因发挥生物学效应。4p53-mir-1246-nfib可能是hcc发生发展中新的信号通路。第三部分:p53-mir-1246-nfib通路在hcc中的临床意义目的:以50例hcc患者临床样本癌组织、癌旁组织及血清为研究对象,检测临床样本组织中p53、mir-1246、nfib的表达水平及分析其相关性,探讨p53-mir-1246-nfib通路在hcc发生发展中的临床意义。方法:1采用westernblot和免疫组织化学(ihc)技术检测p53和nfib蛋白质在肝癌组织和癌旁组织中的表达水平。2采用qrt-pcr检测了肝癌组织和癌旁组织中的mir-1246的表达水平,探讨在hcc患者样本中mir-1246的表达与p53蛋白的表达、nfib蛋白表达的相关性。3通过qrt-pcr技术检测了hcc患者的血清中mir-1246的表达,探讨血清中mir-1246的表达与hcc患者癌组织中mir-1246相关性,从而确定p53-mir-1246-nfib通路的临床意义。结果:1westernblot检测结合灰度扫描分析表明,p53蛋白在50例hcc患者癌组织样本中显著低于其在癌旁组织中的表达(p<0.01);250例hcc癌组织中mir-1246表达水平显著低于其在癌旁组织中的表达水平(p<0.01);进一步采用spss软件相关性分析表明p53蛋白的高表达与miR-1246的高表达具有正相关(r=0.734,P<0.001)。3免疫组织化学(IHC)结果显示50例HCC癌旁组织中NFIB高表达率为24%(12/50),而HCC癌组织中NFIB表达的高表达率为54%(27/50),χ2检验分析表明两组样本间NFIB表达具有显著性差异(P<0.01);SPSS软件相关性分析表明miR-1246表达与NFIB蛋白的表达呈负相关(r=-0.419,P=0.002)。4qRT-PCR检测HCC患者血清中的miR-1246表达结果显示30%(13/43)血清高表达mi R-1246,而70%(30/43)血清中低表达miR-1246,进一步统计分析表明血清中的miR-1246表达量与HCC癌组织中mi R-1246的表达呈正相关(r=0.323,P=0.035)。结论:1在癌旁组织中p53蛋白表达水平显著高于其在HCC患者癌组织中的表达;在癌旁组织中miR-1246表达水平显著高于其在HCC患者癌组织中的表达,p53蛋白表达与mi R-1246表达呈正相关。p53可能参与诱导调控miR-1246表达。2在癌旁组织中NFIB蛋白表达水平显著低于其在HCC患者癌组织中的表达,mi R-1246表达与NFIB蛋白表达呈现负相关,表明miR-1246可能参与负向调控NFIB蛋白表达。3 HCC患者血清中miR-1246表达水平与其在HCC患者癌组织中的表达水平呈正相关,表明HCC癌组织中的miR-1246能够释放到血清中,miR-1246在HCC诊治方面具有重要的临床意义。