球毛壳菌与绿色木霉均为重要的生防真菌。研究它们的生防特性不仅有助于我们进一步了解其生防机理,还可以对相关真菌病害的防治,以及对于了解其它生防真菌的研究起到推动作用。构建报告基因标记的转化子是实现这一目标的有效途径。 本研究优化了生防真菌球毛壳菌原生质体制备与再生条件,一方面研究了裂解酶种类、酶解温度与时间、渗透压稳定剂、菌龄、裂解缓冲液等因素对原生质体释放的影响,另一方面研究了再生培养基类型、渗透压稳定剂与酶解时间等因素对原生质体再生的影响。通过原生质体计数、原生质体活率测定、再生率统计等确定了原生质体制备的最佳条件,即10~8个球毛壳菌孢子在250ml CM培养基中25℃,150rpm培养2-2.5d,过滤取菌丝,在以1%溶壁酶和1.5%蜗牛酶为裂解酶,以0.6M KC1为渗透压稳定剂,以pH=6.0的磷酸盐缓冲液为裂解缓冲液的酶解液中,30℃ 100rpm酶解2h。过滤离心,将原生质体在0.6M KC1中洗涤3次,在以0.76M蔗糖为渗透压稳定剂的OCM培养基中再生。最终得到原生质体产量为10~8原生质体/g菌丝,活率和再生率分别高达98.15%和62.93%,满足原生质体转化的数量和质量要求。 构建了2个EGFP表达载体和一个EYFP表达载体,并成功地将重组载体pBES和启动子陷阱载体pES转化到球毛壳菌原生质体中,将重组载体pCSN43-hph-EYFP转化到绿色木霉原生质体中,得到荧光标记的转化子。经过几轮验证筛选,包括选择性平板筛选、PCR扩增目的片段验证、Southern杂交验证插入片段拷贝数、荧光镜检等,确认EGFP基因/EYFP基因已经插入球毛壳菌/绿色木霉基因组并在其中表达标记。各取一个确认为荧光标记转化子的菌株,进行生防特性分析。主要通过平板共培养、载玻片对峙培养等方法初步研究了球毛壳菌/绿色木霉与植物病原真菌的拮抗机理。绿色木霉的主要抑制机理是对营养和生长空间的强烈竞争作用和重寄生作用。而对球毛壳菌报道较多的是抗生物质的分泌和竞争作用对病原真菌起抑制作用。但是本研究通过荧光镜检GFP标记的球毛壳菌与病原菌的对峙方式发现,球毛壳菌对立枯丝核菌还有明显的重寄生作用。