先天性凝血因子Ⅴ(FactorⅤ,FV)缺乏症也称副血友病,是一种罕见的常染色体隐性遗传病,估计在人群中发病率为1/1000000。FV缺乏症病例的出血症状各不相同,杂合子病例往往无明显的临床出血症状,而纯合子病例则可能有轻度到重度的出血症状。凝血因子Ⅴ基因(F5)的突变是遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症的主要分子基础。至今,全世界有关遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症个例报道约200多例。查询最新的F5基因突变数据库,并对相关文献进行回顾性分析发现,已知的F5基因突变有101种民,其中错义突变46种,缺失突变27种,无义突变14种,插入突变7种,剪接突变7种。遗传性凝血因子ⅩⅢ(FactorⅩⅢ,FⅩⅢ)缺陷症是另外一种罕见常染色体隐性遗传病。其主要的临床表现为终生出血倾向,伤口愈合不良,习惯性流产等。男女均可发病,发病率约为1/2000000。自1960年Duckert等报道首例病例以来,累计报道300多例,国内仅有数例。因子ⅩⅢA链和B链基因突变是遗传性凝血因子ⅩⅢ缺陷症的分子基础。国际凝血因子ⅩⅢ基因突变注册数据库(截至2007年1月)登记的FⅩⅢA基因突变包括:34种错义突变,21种插入/缺失突变,9种剪切位点突变,5种无义突变,FⅩⅢB基因突变仅4种。由此可见FⅩⅢ基因突变以FⅩⅢA基因突变为主,FⅩⅢB基因突变仅占极小比例。近3年来许多国家的研究者相继在人FⅩⅢ基因发现了一些新的突变。对遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症及遗传性凝血因子ⅩⅢ进行分子水平的机制研究不仅有助于这类疾病的分子诊断,更重要的是可以为这类单基因遗传病的基因治疗提供实验依据。　　 目的:分别对一例遗传性凝血因子Ⅴ缺陷症(hereditary factorⅤ deficiency,HFVD)和一例遗传性凝血因子ⅩⅢ缺陷症(hereditary factorⅩⅢ deficiency,HFXIIID)进行家系分析和基因分析,鉴定凝血因子Ⅴ基因和凝血因子ⅩⅢ可能存在的基因变异；以凝血因子Ⅴ基因和凝血因子ⅩⅢ基因突变为研究的切入点,进一步从分子水平研究这些突变致病的分子特征。　　 方法:1.用凝固法对疑似病例及其家庭成员的凝血指标进行检测,提取HFVD家系先证者及其家庭成员的外周血基因组DNA,PCR方法扩增凝血因子Ⅴ基因(F5)全部外显子和侧翼序列,DNA测序方法识别F5的基因突变或多态性。以100例健康体检者为参考,应用等位基因特异PCR或PCR限制性酶切片段长度多态性分析方法对发现的突变进行确证,以排除基因多态性。2.用计算机辅助剪接位点预测程序(NetGene2)对F5剪接受体位点点突变(IVS16-1G>T)的效应进行分析,并构建包含此点突变(IVS16-1G>T)的Minigene,体外试验分析IVS16-1G>T突变对FV mRNA前体剪接的影响。应用生物信息学软件对所发现突变进行分子模建,探讨突变蛋白局部及空间结构的改变。构建含Tyr530Ser错义突变和缺失60个氨基酸残基(1779～1838)的FV基因真核表达载体,脂质体介导的基因转移试验观察FV野生型和突变型重组蛋白在COS-7细胞内的表达特性。3.用尿素溶解试验和定量试剂盒法检测HFXIIID患者及其家系成员血浆FⅩⅢ活性,并用酶联免疫吸附实验测定相应血浆FⅩⅢ抗原含量。PCR方法扩增凝血因子ⅩⅢA基因(F13A)全部外显子和侧翼序列,DNA测序方法识别F13A的基因突变或多态性。应用直接测序、等位基因特异PCR或PCR限制性酶切片段长度多态性分析方法对发现的突变进行确证,以排除基因多态性。4.构建野生型FⅩⅢA重组表达质粒,定点突变方法获得含有两种突变(Arg77Cys及Arg174stop)的FⅩⅢA重组表达质粒。分别将上述重组质粒通过脂质体介导的基因转移方法转染到COS-7细胞表达,荧光定量RT-PCR、Western印迹及酶联免疫吸附实验检测转染细胞中人FⅩⅢA的RNA表达水平和蛋白表达量。　　 结果:1.在HFVD家系中先证者和其妹妹血浆FV活性及血浆FV抗原水平都重度减低,两者的FV基因存在双重杂合子突变,即Tyr530Ser及IVS16-1G>T突变,其中Tyr530Ser突变是因F5外显子11第1763位核苷酸发生C→T杂合突变导致,而IVS16-1G>T突变是发生在F5内含子16剪接受体位点的点突变。家系分析表明Tyr530Ser突变和IVS16-1G>T突变分别遗传自其父、母亲,其父为Tyr530Ser突变携带者,其母为IVS16-1G>T突变携带者。KpnI酶切分析及等位基因特异的PCR实验结果表明100例健康体检者中均不存在这两种突变。2.成功构建含有点突变(IVS16-1G>T)的F5 Minigene。NetGene2程序能够识别野生型F5基因第16内含子受体剪接位点,不能识别发生突变的第16内含子受体剪接位点。体外将野生型和突变型F5 minigene重组体转到COS7细胞,RT-PCR和DNA测序证实,从野生型minigene转染组扩增得到的PCR产物长度为452 bp,然而从突变型minigene转染组扩增得到的PCR产物长度为272 bp。基因测序分析证明突变转录本恰好缺失了180 bp长的外显子17。计算机模拟分析预测一旦530位氨基酸变为Ser,将不能维系和Glu330及Tyr415之间的氢键。由IVS16-1G>T突变导致缺失的60个氨基酸残基位于FV分子的A3结构域。这一缺失不仅导致FV A3结构域C端β桶结构被破坏,还导致铜离子与His1815和His1817之间协同作用的丧失。Western blot实验证实在细胞裂解物中野生型FV和两种突变的FVs均有表达。EIISA进一步证实Tyr530Ser和△1779-1838突变的FV抗原表达量分别降到野生型FV蛋白表达量的79.5％和60.0％。野生型重组FV蛋白能够被有效分泌到培养基中(FV:C60.7±19.7％；FV:Ag8.5±0.8μg/ml)。但是与转染野生型表达质粒组比较,转染两种突变质粒的COS-7细胞培养上清中检测到的FV抗原水平则明显减低。预测的Tyr530SerFV突变蛋白和△1779-1838突变FV蛋白的特异性活性分别是0.012 U/μg和0.043 U/μg。3.HFXIIID家系先证者FⅩⅢ基因第3外显子和第4外显子分别存在Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变,后者是人FⅩⅢ基因一种新突变。家系分析表明这2个突变是双重杂合子型,Arg77Cys突变遗传自父亲,Arg174stop突变遗传自母亲。先证者女儿携带Arg77Cys错义突变。先证者丈夫及100名健康对照者均未发现Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变。4.成功构建人FⅩⅢA表达质粒,并通过定点突变成功构建含有两种突变(Arg77Cys及Arg174stop)的FⅩⅢA重组表达质粒。含有两种突变(Arg77Cys及Arg174stop)的FⅩⅢA重组质粒转染组FⅩⅢA mRNA相对表达丰度分别为0.82±0.21和0.76±0.17,与野生型FⅩⅢA重组质粒转染组(1.06±0.51)比较没有显著性差异(P>0.05)。野生型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物中FⅩⅢ活性为61.6±30.4％,浓缩的细胞培养上清液中FⅩⅢ活性为24.0±2.9％。而两种突变型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物及培养上清液FⅩⅢ活性明显减低。转染细胞裂解物的Western Blot分析发现含Arg77Cys错义突变的FⅩⅢA重组蛋白在培养细胞内含量严重减低,仅见一条微弱的条带。ELISA证实野生型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物中FⅩⅢA:Ag量为32.8±14.5％％,浓缩的细胞培养上清液中FⅩⅢ:Ag量为13.2±2.3％。而两种突变型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物及培养上清液中FⅩⅢA:Ag水平极度减低,低于ELISA检测低限。　　 结论:1.在一个遗传性HFVD家系中证实先证者和其同胞妹妹均为F5Tyr530Ser突变及IVS16-1G>T突变的双重杂合子。两例患者均表现为重度凝血因子Ⅴ缺乏,提示F5 Tyr530Ser突变及IVS16-1G>T突变共同导致了凝血因子Ⅴ功能的严重缺陷。2.体外COS-7细胞转染实验证实IVS16-1G>T。突变确实可以导致F5第17号外显子跳跃(Skipping),将因此导致合成缺陷型FV蛋白,其A3结构域内缺失60个氨基酸残基(从1779-1838共60个氨基酸)。两种FV突变体的体外表达实验结果提示Tyr530Ser突变和IVS16-1G>T突变单独都可以导致FV重组蛋白表达量的严重减低,因此与FV重度缺乏密切相关。3.发现人FⅩⅢ基因一种新突变,即Arg174stop无义突变,并成功建立此突变的PCR限制性片段长度多态性检测方法。先证者因子ⅩⅢ基因同时存在Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变,可能是其因子ⅩⅢ色天性缺陷的因为。4.体外实验结果表明F13A Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变未导致FⅩⅢA mRNA水平的显著减低,但都可以导致FⅩⅢA蛋白水平的表达异常。在本研究先天性FⅩⅢ缺陷症患者中FⅩⅢA重度缺乏可能是F13A Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变的共同作用所致。