WNT5A对胰腺癌细胞化疗耐药及肿瘤血管生成作用的研究

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背景:胰腺癌(Pancreatic carcinoma, PC)是胰腺组织的恶性肿瘤,VNT5A由胰腺癌细胞(Pancreatic carcinoma cells, PCCs)产生,在肿瘤的进展过程中起重要作用。目前,有关WNT5A在胰腺癌组织中表达的病例分析比较缺乏。并且,虽然已有报道WNT5A激活PCCs的侵袭和迁移,但有关WNT5A在胰腺癌化疗耐药和血管生成方面的作用还有待研究。目的:本文通过对WNT5A在胰腺癌病理组织中的表达,以及VNT5A在PCCs对吉西他滨的耐药、血管生成方面作用的研究,为胰腺癌的治疗提供新的思路。方法:1.收集手术切除并经病理确诊的胰腺癌标本68例,通过免疫组织化法对肿瘤和癌旁组织的WNT5A表达量进行分析,并分析其与年龄、性别、临床TNM分期、肿瘤分级、发生部位和肿瘤大小之间的关系;2.通过小RNA干扰方法干扰WNT5A,检测在干扰前后胰腺癌细胞系PANC-1, MiaPaCa2和Capan-2对吉西他滨敏感性变化。构建WNT5A干扰和过表达质粒系统,建立稳定转染细胞,并应用CCK8细胞毒实验技术验证转染细胞对吉西他滨耐药性的改变。3.应用流式细胞技术研究干扰WNT5A对细胞周期的影响。应用实时定量PCR方法检测细胞周期蛋白的mRNA相对表达水平。应用Western blotting对WNT5A影响细胞周期蛋白的机制进行研究,寻找WNT5A作用靶点激酶。通过免疫沉淀实验研究WNT5A调控细胞周期时相的机制。4.通过免疫印迹检测缺氧诱导因子HIF-1α的表达量,并通过细胞免疫荧光实验检测其在细胞质/细胞核的表达改变。应用实时定量PCR检测血管内皮生长因子VEGF的转录水平,并通过ELISA试剂盒检测PCCs上清液中VEGF的表达量;5.应用Transwell小室共培养PCCs和人脐静脉内皮细胞HUVECs,通过细胞计数检测HUVECs细胞增殖情况,通过划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移情况;6.构建BALB/c裸鼠异体移植瘤模型,测量裸鼠肿瘤大小计算体积,绘制肿瘤增长曲线。接种30天后取瘤进行免疫组化,分析移植瘤中HIF-1α的表达量,并通过CD34染色计算微血管密度。结果:1.免疫组化结果显示,WNT5A在胰腺癌中呈阳性表达在癌旁组织中呈阴-弱阳性表达,并且WNT5A染色评分与临床分期与肿瘤大小相关,随着TNM分期增加,WNT5A染色强度增加;2.敲除WNT5A造成PANC-1、MiaPaCa2和Capan-2对吉西他滨耐受性下降,通过构建稳定干扰和过表达WNT5A的PANC-1细胞系,同样观测到其对吉西他滨的耐受性随着WNT5A的改变而改变;3.通过流式测细胞周期发现干扰WNT5A导致细胞周期G1期停滞,Cyclin D mRNA水平的下降,这种改变伴随Ser473AKT磷酸化,抑制PI3K/AKT可以阻断WNT5A对Cyclin D蛋白表达的促进作用。通过对G1/S限制点调控蛋白pRb-E2F的检测,发现干扰WNT5A可以稳定pRb,使pRb-E2F复合物构象稳定,强化限制点功能;4. WNT5A可以增加HIF-1α的稳定性,并且促进其细胞核转移,从而激活其靶基因VEGF mRNA水平增加和蛋白分泌增加;5.共培养PCCs和HUVECs促进后者增殖和迁移能力,体内实验证实干扰WNT5A导致胰腺癌肿瘤生长停滞,微血管密度减少。结论:1. WNT5A在胰腺癌中高表达,并且与TNM分期相关;2. WNT5A通过磷酸化AKT激活Cyclin D表达,后者促进pRb-E2F复合物解聚,细胞易于通过细胞周期G1/S检测点,并造成PCCs对吉西他滨的耐药;3. WNT5A通过促进HIF-1α的稳定表达及核转移,激活VEGF的表达和分泌,从而引起HUVECs的增殖和迁移,导致肿瘤血管新生。
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